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DNA實(shí)驗(yàn)技術(shù)：多藥抗藥基因的表達(dá)實(shí)驗(yàn)

2013-7-27　　閱讀(1446)

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多藥抗藥基因的表達(dá)實(shí)驗(yàn)

標(biāo)簽： 抗藥 基因

多藥抗藥基因的表達(dá)實(shí)驗(yàn)是通過反轉(zhuǎn)錄和PCR的方法來檢測(cè)特定基因的過度表達(dá)。

實(shí)驗(yàn)方法
  • PCR擴(kuò)增法
實(shí)驗(yàn)方法原理 大多MDR細(xì)胞膜上出現(xiàn)MDR-1基因及其基因產(chǎn)物P-糖蛋白過度表達(dá),。
實(shí)驗(yàn)材料
試劑,、試劑盒
儀器,、耗材
實(shí)驗(yàn)步驟

一、細(xì)胞總RNA提取

1.  收集約5×107個(gè)細(xì)胞,，冷PBS洗滌,。

2.  加入400 ul RNA提取液（含6 mol/l 的異硫氰酸肽，0.5%十二烷基肌酸鈉,，0.025 mol/l 構(gòu)櫞酸鈉pH7.0,，0.25 mol/l 乙酸鈉，pH4.0,，0.5%二疏基乙醇,，50%萘酸），混勻,。

3.  加入400 ul 氯仿,，混勻，以13 000 r/min 于4℃離心15 min,。

4.  取上清液加入等體積的異丙醇,，4℃放置30 min。

5.  然后以13 000 r/min 離心15 min,，吸上清,，將RNA成點(diǎn)用75%的乙醇洗滌1次，溶于100 ul 的無菌雙蒸餾水中,。

6.  并用紫外分光光度計(jì)檢測(cè)RNA純度（A260/A280應(yīng)為1.8~2.0）后備用,。

二、反轉(zhuǎn)錄及PCR擴(kuò)增

1.  引物
 


2.  取細(xì)胞總RNA10 ul 加入20 ul AMV逆轉(zhuǎn)錄酶反應(yīng)體系中,，42℃保溫30 min 進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄,，合成cDNA。

3.  然后置95℃,，3 min 終止反轉(zhuǎn)錄,。

4.  接著在Taq酶的作用下，用mdr-1和β2-MG引物,，對(duì)cDNA上的目的片段進(jìn)行PCR

5.  94℃預(yù)變性2 min,，然后94℃變性1 min，50℃退火1 min,，72℃延伸1 min,，擴(kuò)增35個(gè)循環(huán)。

6.  zui終在60℃保溫7 min,，以保證產(chǎn)物充分延伸,。

7.  取10 ul 擴(kuò)增產(chǎn)物在3%瓊脂糖凝膠電泳后，紫外燈下照相,，與mdr-1 cDNA陽性對(duì)照,，等位的DNA條帶為陽性,，反之為陰性。

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