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DNA實驗技術(shù)：多藥抗藥基因的表達實驗

2013-7-27　　閱讀(1486)

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多藥抗藥基因的表達實驗

標簽： 抗藥 基因

多藥抗藥基因的表達實驗是通過反轉(zhuǎn)錄和PCR的方法來檢測特定基因的過度表達,。

實驗方法
  • PCR擴增法
實驗方法原理 大多MDR細胞膜上出現(xiàn)MDR-1基因及其基因產(chǎn)物P-糖蛋白過度表達,。
實驗材料
試劑,、試劑盒
儀器、耗材
實驗步驟

一,、細胞總RNA提取

1.  收集約5×107個細胞,，冷PBS洗滌。

2.  加入400 ul RNA提取液（含6 mol/l 的異硫氰酸肽,，0.5%十二烷基肌酸鈉,，0.025 mol/l 構(gòu)櫞酸鈉pH7.0，0.25 mol/l 乙酸鈉,，pH4.0,，0.5%二疏基乙醇，50%萘酸）,，混勻,。

3.  加入400 ul 氯仿，混勻,，以13 000 r/min 于4℃離心15 min,。

4.  取上清液加入等體積的異丙醇，4℃放置30 min,。

5.  然后以13 000 r/min 離心15 min,，吸上清，將RNA成點用75%的乙醇洗滌1次,，溶于100 ul 的無菌雙蒸餾水中,。

6.  并用紫外分光光度計檢測RNA純度（A260/A280應為1.8~2.0）后備用。

二,、反轉(zhuǎn)錄及PCR擴增

1.  引物
 


2.  取細胞總RNA10 ul 加入20 ul AMV逆轉(zhuǎn)錄酶反應體系中,，42℃保溫30 min 進行反轉(zhuǎn)錄，合成cDNA,。

3.  然后置95℃，3 min 終止反轉(zhuǎn)錄,。

4.  接著在Taq酶的作用下,，用mdr-1和β2-MG引物，對cDNA上的目的片段進行PCR

5.  94℃預變性2 min,，然后94℃變性1 min,，50℃退火1 min，72℃延伸1 min,，擴增35個循環(huán),。

6.  zui終在60℃保溫7 min，以保證產(chǎn)物充分延伸,。

7.  取10 ul 擴增產(chǎn)物在3%瓊脂糖凝膠電泳后,，紫外燈下照相,，與mdr-1 cDNA陽性對照，等位的DNA條帶為陽性,，反之為陰性,。

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