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本文先講zui簡單的一個點的定點突變技術，其它較長片段的突變,，刪除，插入技術以后會慢慢奉上：
在做實驗之前,，我們首先要搞清楚實驗的目的和實驗的原理,。
實驗的目的應該比較明確吧：就是要把自己的基因上面的一個堿基換成另外一個堿基。一般情況下我們會有幾種可能使我們需要這樣去做：
* 我們吊出來的基因有點突變,，相信這可能是大家經常會遇到的問題,。基因好不容易吊出來,，并裝進了自己的載體,，卻發(fā)現(xiàn)有一兩個堿基跟自己的預期序列或所有的公共數據庫不匹配，然后暴昏,。
大家實驗室里面還是用Taq酶為主吧,，Pfu這樣的高保真酶大家應該用得不多吧，Taq酶的優(yōu)點和缺點都很明顯：優(yōu)點就是擴增效能強,，缺點就是保真性差,，其錯配機率是比較高的，相關數字忘了，大家可以去網上查那個數字,，不過感覺如果是2000bp的基因,，如果擴四五十個循環(huán)的話，很大機率會出現(xiàn)點突變,，當然這也跟具體PCR體系里的Buffer有很大關系,，詳細情況這里就不討論了。
第二 要研究基因的功能,，在基因上自己選定位置更換堿基的保守序列,，或者改造成不同的亞型，總之就是要人工改造堿基序列符合自己的實驗需要,，相信這也是那些研究基因的人經常的一種思路吧,。
對于*種情況：我們首先要分析出現(xiàn)堿基不匹配的位置是不是重要的位置，如果不是很重要,，大可不必管它,，比如說是三聯(lián)密碼子的zui后一位，堿基的改變并沒有引起相應氨基酸的改變,，那么一般情況下也可以不去理它,。另外，在NCBI上人類的基因的版本一直在變化,，也就是說同一個基因有不同的版本,，或者稱不同的亞型，其堿基序列有些許的差異,，只要自己克隆出來的堿基序列與其中一個相匹配,，一般也就可以不做定點突變了。如果有時間沒錢,，那干脆重新PCR然后再克隆進自己的載體了,，不過換個保真性好一點的酶如PFU，或者PCR循環(huán)數低一點,，不過這些東西有時候也得靠運氣啦,。實在不行的話再來做定點突變。
對于第二種情況：這種情況下一般也就只能做定點突變了,。
接下來開始聊一聊定點突變的原理吧,。
那個Stratagene試劑盒！上面有一個說明書,，說得好像很正規(guī),，不過上面好多都是什么啊什么注意之類的話，看都不看,，我們簡明扼要地只講實驗方面,，通過設計引物，并利用PCR將模板擴增出來，然后去掉模板,，剩下來的就是我們的PCR產物,，在PCR產物上就已經把這個點變過來了，然后再轉化,，篩選陽性克隆，再測序確定就行了,。
大家馬上就會想到幾個問題了：
*：引物怎么設計呢,？
第二：模板怎么去掉呢？
第三：怎么拿到質粒呢,？
對于*個問題：怎么設計引物,？
我只能講一些原則，并舉一些例子,。
引物設計的原則其它貼子上都有講,，這里就不重復了。不過這種突變引物要加上一個原則：一般都是以要突變的堿基為中心,，加上兩邊的一段序列,，兩邊長度至少為11-12base pair。
若兩邊引物太短了,，很可能會造成突變實驗失敗,，大家應該都知道，引物至少要11-12個base pair才能與模板搭上,，而這種突變PCR要求兩邊都能與引物搭上,，所以兩邊各設至少12個base pair，并且合成多一條反向互補的引物,。
這么說大家可能不是很清楚,，那我就舉個例子吧：
X71661.1 TATCAGGAGGAATTTGAGCACTTTCAACAAGAATTGGATAAAAAAAAAGAGGAATTCCAG 960
現(xiàn)有序列 TATCAGGAGGAATTTGAGCACTTTCAACAAGAATTGGATAAAAAAAAAGAGGAATTCCAG 924
X71661.1 AAGGGCCACCCCGACCTCCAAGGGCAGCCTGCGGAGGAAATATTTGAGAGTGTAGGAGAT 1020
現(xiàn)有序列 AAGGGCCACCCCGACCTCCAAGGGCAGCCTGCGGAGGAAATATTTGAGAGTGTAGGAGAT 984
（上面為目的序列，下面為現(xiàn)有序列：我們發(fā)現(xiàn)有一個A堿基的缺失,，其直接結果是在表達蛋白時后面的氨基酸全部錯配）
我們以它為中心設計引物：兩邊各至少12個堿基,，左邊由于含有較多的A造成引物GC%含量過低，故拉長引物使GC%含量不至過低,，也使引物退火溫度升高,。
故合成引物CAACAAGAATTGGATAAAAAAAAAGAGGAATTCCAGAAG
并合成反向互補引物CTTCTGGAATTCCTCTTTTTTTTTATCCAATTCTTGTTG
其實也不一定要反向互補序列，只要反向引物也是兩邊都有大于12個堿基,，同時符合引物設計的原則就行了,。
引物合成公司有很多家，大家可以去尋找,，不同廠家的引物在價錢質量上有一些差別,，不過價錢一般都是一塊多一個堿基，合成時間約為一周。
這樣的結果是PCR時把整個質粒都給擴出來了,，得到的PCR產物是一條鏈完整,，另一鏈有缺刻的PCR產物。
對于第二個問題：
怎么去掉模板呢,？再簡單的方法就是用DpnI酶,，DpnI能夠識別甲基化位點并將其酶切，我們用的模板一般都是雙鏈超螺旋質粒,，從大腸桿菌里提出來的質粒一般都被甲基化保護起來（除非你用的是甲基化缺陷型的菌株）,，而PCR產物都是沒有甲基化的，所以DpnI酶能夠特異性地切割模板（質粒）而不會影響PCR產物,，從而去掉模板留下PCR產物,，所以提質粒時那些菌株一定不能是甲基化缺陷株，不會那么湊巧吧,。
關于第三個問題：
直接把通過DpnI處理的PCR產物拿去做轉化就行了,，呵呵，然后再篩選出陽性克隆,，并提出質粒,，拿去測序（這個就不用我多說了吧），驗證突變結果,，一般都沒問題的啦,，我做了幾十個突變了，到目前為止還沒有做不出來的,。
下面講一下具體的實驗步驟以及一些實驗中要注意的事情
1,、 根據現(xiàn)有基因設計引物；
2,、 合成引物并準備好模板,；
3、 PCR,，
4,、 DpnI處理酶切產物；
5,、 轉化酶切產物,；
6、 篩選 陽性克??；
7、 送測序并測全長,。
zui后就是慶祝啦,，沒什么復雜的,。
引物和質粒都準備好后，當然就是做PCR嘍,，不過對于PCR的酶和buffer,，不能用平時的，我們做PCR把整個質粒擴出來,，延伸長度達到幾個K,，所以要用那些GC buffer或擴增長片段的buffer，另外,，要用保真性能較好的PFU酶來擴增,，防止引進新的突變。
那種Quick change試劑盒分為幾種不同的類型,。什么QuikChange® Site-Directed Mutagenesis Kit標準點突變試劑盒 、QuikChange® XL Site-Directed Mutagenesis Kit長模板單點突變試劑盒（>8kb）從原理上是一樣的,，只是PCR的酶和BUFFER不一樣,，后面用了比較適合長片段擴增的酶和BUFFER罷了，沒什么特別的東西,。
另外,，DpnI處理的時間長一點，zui少一個小時吧,，能有兩三個小時,，因為如果模板處理得不干凈，哪怕只有那么一點點,，模板直接在平板上長出來,，就會導致實驗失敗。
實驗板長出來的菌有兩種可能：一種是質粒DPNI沒處理干凈長出來的（模板）,，一種是PCR產物轉化出來的 （突變體）
不過這兩種菌長得一模一樣,，即使提出質粒來也是一樣（酶切和PCR都無法區(qū)分），除了測序,，是分不出來的,，做PCR時也做一個負對照（不加引物），實驗管由于PCR時有引物,，所以在DNPI處理前里面既含有模板又含有PCR產物,，而對照管由于PCR時沒放引物，所以在DPNI處理前里面只有模板,。
如果兩者都拿去DNPI處理就能夠證明模板已經被去除干凈,。若實驗順利的話應該是：正對照長菌負對照不長菌。如果出現(xiàn)正負對照都長菌,，那么就是DpnI沒處理好,，如果正負對照都不長菌,，那么有兩種可能，一種是PCR陰性,，也就是說PCR出問題了,，另外一個可能就是轉化出問題了。要搞清楚是哪個問題,，跑膠說明不了問題,，那就做個轉化的對照，拿試劑盒的對照實驗去試感受態(tài),，馬上就能知道轉化有沒問題,。如果正對照很多菌，負對照有幾個菌,，那么就是DPNI處理得不干凈,，這個時候就得靠運氣了。
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