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本文先講zui簡(jiǎn)單的一個(gè)點(diǎn)的定點(diǎn)突變技術(shù)，其它較長(zhǎng)片段的突變,，刪除,，插入技術(shù)以后會(huì)慢慢奉上：

在做實(shí)驗(yàn)之前，我們首先要搞清楚實(shí)驗(yàn)的目的和實(shí)驗(yàn)的原理,。

實(shí)驗(yàn)的目的應(yīng)該比較明確吧：就是要把自己的基因上面的一個(gè)堿基換成另外一個(gè)堿基,。一般情況下我們會(huì)有幾種可能使我們需要這樣去做：

* 我們吊出來的基因有點(diǎn)突變，相信這可能是大家經(jīng)常會(huì)遇到的問題,?；蚝貌蝗菀椎醭鰜恚⒀b進(jìn)了自己的載體,，卻發(fā)現(xiàn)有一兩個(gè)堿基跟自己的預(yù)期序列或所有的公共數(shù)據(jù)庫不匹配,，然后暴昏。

大家實(shí)驗(yàn)室里面還是用Taq酶為主吧,，Pfu這樣的高保真酶大家應(yīng)該用得不多吧,，Taq酶的優(yōu)點(diǎn)和缺點(diǎn)都很明顯：優(yōu)點(diǎn)就是擴(kuò)增效能強(qiáng)，缺點(diǎn)就是保真性差,，其錯(cuò)配機(jī)率是比較高的,，相關(guān)數(shù)字忘了，大家可以去網(wǎng)上查那個(gè)數(shù)字,，不過感覺如果是2000bp的基因,，如果擴(kuò)四五十個(gè)循環(huán)的話，很大機(jī)率會(huì)出現(xiàn)點(diǎn)突變,，當(dāng)然這也跟具體PCR體系里的Buffer有很大關(guān)系,，詳細(xì)情況這里就不討論了。

第二 要研究基因的功能,，在基因上自己選定位置更換堿基的保守序列,，或者改造成不同的亞型，總之就是要人工改造堿基序列符合自己的實(shí)驗(yàn)需要,，相信這也是那些研究基因的人經(jīng)常的一種思路吧,。

對(duì)于*種情況：我們首先要分析出現(xiàn)堿基不匹配的位置是不是重要的位置，如果不是很重要,，大可不必管它,，比如說是三聯(lián)密碼子的zui后一位,，堿基的改變并沒有引起相應(yīng)氨基酸的改變，那么一般情況下也可以不去理它,。另外,，在NCBI上人類的基因的版本一直在變化，也就是說同一個(gè)基因有不同的版本,，或者稱不同的亞型,，其堿基序列有些許的差異,，只要自己克隆出來的堿基序列與其中一個(gè)相匹配,，一般也就可以不做定點(diǎn)突變了。如果有時(shí)間沒錢,，那干脆重新PCR然后再克隆進(jìn)自己的載體了,，不過換個(gè)保真性好一點(diǎn)的酶如PFU，或者PCR循環(huán)數(shù)低一點(diǎn),，不過這些東西有時(shí)候也得靠運(yùn)氣啦,。實(shí)在不行的話再來做定點(diǎn)突變。

對(duì)于第二種情況：這種情況下一般也就只能做定點(diǎn)突變了,。

接下來開始聊一聊定點(diǎn)突變的原理吧,。

那個(gè)Stratagene試劑盒！上面有一個(gè)說明書,，說得好像很正規(guī),，不過上面好多都是什么啊什么注意之類的話，看都不看,，我們簡(jiǎn)明扼要地只講實(shí)驗(yàn)方面,，通過設(shè)計(jì)引物，并利用PCR將模板擴(kuò)增出來,，然后去掉模板,，剩下來的就是我們的PCR產(chǎn)物，在PCR產(chǎn)物上就已經(jīng)把這個(gè)點(diǎn)變過來了,，然后再轉(zhuǎn)化,，篩選陽性克隆，再測(cè)序確定就行了,。

大家馬上就會(huì)想到幾個(gè)問題了：

*：引物怎么設(shè)計(jì)呢,？

第二：模板怎么去掉呢？

第三：怎么拿到質(zhì)粒呢,？

對(duì)于*個(gè)問題：怎么設(shè)計(jì)引物,？

我只能講一些原則，并舉一些例子,。

引物設(shè)計(jì)的原則其它貼子上都有講,，這里就不重復(fù)了,。不過這種突變引物要加上一個(gè)原則：一般都是以要突變的堿基為中心，加上兩邊的一段序列,，兩邊長(zhǎng)度至少為11-12base pair,。

若兩邊引物太短了，很可能會(huì)造成突變實(shí)驗(yàn)失敗,，大家應(yīng)該都知道,，引物至少要11-12個(gè)base pair才能與模板搭上，而這種突變PCR要求兩邊都能與引物搭上,，所以兩邊各設(shè)至少12個(gè)base pair,，并且合成多一條反向互補(bǔ)的引物。

這么說大家可能不是很清楚,，那我就舉個(gè)例子吧：

X71661.1 TATCAGGAGGAATTTGAGCACTTTCAACAAGAATTGGATAAAAAAAAAGAGGAATTCCAG 960

現(xiàn)有序列 TATCAGGAGGAATTTGAGCACTTTCAACAAGAATTGGATAAAAAAAAAGAGGAATTCCAG 924

X71661.1 AAGGGCCACCCCGACCTCCAAGGGCAGCCTGCGGAGGAAATATTTGAGAGTGTAGGAGAT 1020

現(xiàn)有序列 AAGGGCCACCCCGACCTCCAAGGGCAGCCTGCGGAGGAAATATTTGAGAGTGTAGGAGAT 984

（上面為目的序列,，下面為現(xiàn)有序列：我們發(fā)現(xiàn)有一個(gè)A堿基的缺失，其直接結(jié)果是在表達(dá)蛋白時(shí)后面的氨基酸全部錯(cuò)配）

我們以它為中心設(shè)計(jì)引物：兩邊各至少12個(gè)堿基,，左邊由于含有較多的A造成引物GC%含量過低,，故拉長(zhǎng)引物使GC%含量不至過低，也使引物退火溫度升高,。

故合成引物CAACAAGAATTGGATAAAAAAAAAGAGGAATTCCAGAAG 

并合成反向互補(bǔ)引物CTTCTGGAATTCCTCTTTTTTTTTATCCAATTCTTGTTG

其實(shí)也不一定要反向互補(bǔ)序列,，只要反向引物也是兩邊都有大于12個(gè)堿基，同時(shí)符合引物設(shè)計(jì)的原則就行了,。

引物合成公司有很多家,，大家可以去尋找，不同廠家的引物在價(jià)錢質(zhì)量上有一些差別,，不過價(jià)錢一般都是一塊多一個(gè)堿基,，合成時(shí)間約為一周。

這樣的結(jié)果是PCR時(shí)把整個(gè)質(zhì)粒都給擴(kuò)出來了,，得到的PCR產(chǎn)物是一條鏈完整,，另一鏈有缺刻的PCR產(chǎn)物。

對(duì)于第二個(gè)問題：

怎么去掉模板呢,？再簡(jiǎn)單的方法就是用DpnI酶,，DpnI能夠識(shí)別甲基化位點(diǎn)并將其酶切，我們用的模板一般都是雙鏈超螺旋質(zhì)粒,，從大腸桿菌里提出來的質(zhì)粒一般都被甲基化保護(hù)起來（除非你用的是甲基化缺陷型的菌株）,，而PCR產(chǎn)物都是沒有甲基化的，所以DpnI酶能夠特異性地切割模板（質(zhì)粒）而不會(huì)影響PCR產(chǎn)物,，從而去掉模板留下PCR產(chǎn)物,，所以提質(zhì)粒時(shí)那些菌株一定不能是甲基化缺陷株，不會(huì)那么湊巧吧,。

關(guān)于第三個(gè)問題：

直接把通過DpnI處理的PCR產(chǎn)物拿去做轉(zhuǎn)化就行了,，呵呵,，然后再篩選出陽性克隆，并提出質(zhì)粒,，拿去測(cè)序（這個(gè)就不用我多說了吧）,，驗(yàn)證突變結(jié)果，一般都沒問題的啦,，我做了幾十個(gè)突變了,，到目前為止還沒有做不出來的。

下面講一下具體的實(shí)驗(yàn)步驟以及一些實(shí)驗(yàn)中要注意的事情

1,、  根據(jù)現(xiàn)有基因設(shè)計(jì)引物,；

2、  合成引物并準(zhǔn)備好模板,；

3,、  PCR，

4,、  DpnI處理酶切產(chǎn)物；

5,、  轉(zhuǎn)化酶切產(chǎn)物,；

6、  篩選 陽性克??；

7、  送測(cè)序并測(cè)全長(zhǎng),。

zui后就是慶祝啦,，沒什么復(fù)雜的。

引物和質(zhì)粒都準(zhǔn)備好后,，當(dāng)然就是做PCR嘍,，不過對(duì)于PCR的酶和buffer，不能用平時(shí)的,，我們做PCR把整個(gè)質(zhì)粒擴(kuò)出來,，延伸長(zhǎng)度達(dá)到幾個(gè)K，所以要用那些GC buffer或擴(kuò)增長(zhǎng)片段的buffer,，另外,，要用保真性能較好的PFU酶來擴(kuò)增，防止引進(jìn)新的突變,。

那種Quick change試劑盒分為幾種不同的類型,。什么QuikChange® Site-Directed Mutagenesis Kit標(biāo)準(zhǔn)點(diǎn)突變?cè)噭┖?、QuikChange® XL Site-Directed Mutagenesis Kit長(zhǎng)模板單點(diǎn)突變?cè)噭┖校?gt;8kb）從原理上是一樣的,，只是PCR的酶和BUFFER不一樣,，后面用了比較適合長(zhǎng)片段擴(kuò)增的酶和BUFFER罷了,，沒什么特別的東西。

另外,，DpnI處理的時(shí)間長(zhǎng)一點(diǎn),，zui少一個(gè)小時(shí)吧，能有兩三個(gè)小時(shí),，因?yàn)槿绻０逄幚淼貌桓蓛?，哪怕只有那么一點(diǎn)點(diǎn)，模板直接在平板上長(zhǎng)出來,，就會(huì)導(dǎo)致實(shí)驗(yàn)失敗,。

實(shí)驗(yàn)板長(zhǎng)出來的菌有兩種可能：一種是質(zhì)粒DPNI沒處理干凈長(zhǎng)出來的（模板），一種是PCR產(chǎn)物轉(zhuǎn)化出來的 （突變體）

不過這兩種菌長(zhǎng)得一模一樣,，即使提出質(zhì)粒來也是一樣（酶切和PCR都無法區(qū)分）,，除了測(cè)序，是分不出來的,，做PCR時(shí)也做一個(gè)負(fù)對(duì)照（不加引物）,，實(shí)驗(yàn)管由于PCR時(shí)有引物，所以在DNPI處理前里面既含有模板又含有PCR產(chǎn)物,，而對(duì)照管由于PCR時(shí)沒放引物,，所以在DPNI處理前里面只有模板。

如果兩者都拿去DNPI處理就能夠證明模板已經(jīng)被去除干凈,。若實(shí)驗(yàn)順利的話應(yīng)該是：正對(duì)照長(zhǎng)菌負(fù)對(duì)照不長(zhǎng)菌,。如果出現(xiàn)正負(fù)對(duì)照都長(zhǎng)菌，那么就是DpnI沒處理好,，如果正負(fù)對(duì)照都不長(zhǎng)菌,，那么有兩種可能，一種是PCR陰性,，也就是說PCR出問題了,，另外一個(gè)可能就是轉(zhuǎn)化出問題了。要搞清楚是哪個(gè)問題,，跑膠說明不了問題,，那就做個(gè)轉(zhuǎn)化的對(duì)照，拿試劑盒的對(duì)照實(shí)驗(yàn)去試感受態(tài),，馬上就能知道轉(zhuǎn)化有沒問題,。如果正對(duì)照很多菌，負(fù)對(duì)照有幾個(gè)菌,，那么就是DPNI處理得不干凈,，這個(gè)時(shí)候就得靠運(yùn)氣了。