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中級(jí)會(huì)員·14年您現(xiàn)在的位置： 首頁(yè)> 公司動(dòng)態(tài)> DNA專題：血基因組DNA提取實(shí)驗(yàn)
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血基因組DNA提取可以：（1）從凍全血,、血漿,、血清,、骨髓,、其他體液、淋巴細(xì)胞,、培養(yǎng)細(xì)胞,、病毒和線粒體中提取DNA；（2）用于后續(xù)測(cè)序,、遺傳信息學(xué)等研究,。
實(shí)驗(yàn)方法
- 血基因組DNA 試劑盒提取法
- 血基因組DNA大量試劑盒提取法
- 血基因組DNA中量試劑盒提取法
| 實(shí)驗(yàn)方法原理 | 本試劑盒采用*的兩相分離技術(shù),，結(jié)合DNA制備膜選擇性地吸附DNA的方法達(dá)到純化基因組DNA的目的,。適合從3ml的抗凝人或哺乳動(dòng)物全血獲得100 μg的基因組DNA，抗凝鳥類或兩棲動(dòng)物全血中獲得多至120 μg的基因組DNA,。 |
|---|---|
| 實(shí)驗(yàn)材料 | 抗凝全血 |
| 試劑,、試劑盒 | 血基因組DNA中量試劑盒 |
| 儀器、耗材 | 中量制備管 中量濾器 連接管 塑料扳手 中量管蓋 |
| 實(shí)驗(yàn)步驟 | 一,、試劑盒組成,、貯存、穩(wěn)定性 說(shuō)明書,，耗材：中量制備管,、中量濾器、連接管,、塑料扳手,、中量管蓋。 Buffer VL：細(xì)胞和病毒裂解液,，室溫密閉貯存,。 Buffer G-B：蛋白沉淀液，室溫密閉貯存,。 Buffer DV-A：Buffer DV 的制備液,，請(qǐng)參照實(shí)驗(yàn)準(zhǔn)備Buffer DV 的配制方法配制，室溫密閉貯存,。 Buffer DV：相分離液,，室溫密閉貯存。 Buffer BV：DNA 結(jié)合液,，室溫密閉貯存,。 Buffer W1：洗滌液，室溫密閉貯存,。 Buffer W2 concentrate：去鹽液,。使用前，根據(jù)瓶上數(shù)量加入乙醇,，混合均勻,，室溫密閉貯存?？捎?00%乙醇或95%乙醇,。 Eluent：2.5 mM Tris-HCl，pH 8.5,，室溫密閉貯存,。 二、實(shí)驗(yàn)準(zhǔn)備 1. *次使用時(shí)，在Buffer W2 concentrate 中按試劑瓶上的體積加入無(wú)水乙醇,。 2. 準(zhǔn)備無(wú)核酸和核酸酶污染的Tip 頭,、離心管。 3. 制備Buffer DV：取2 ml Buffer DV-A 125 ml 異丙醇,，75 ml 異丁醇,，加入提供的250 ml 試劑瓶中，混合均勻,。 4. 4℃預(yù)冷Buffer DV,。 三、操作步驟 【DNA 釋放 】 1. 將3 ml 抗凝全血加入一50 ml 離心管中,，若全血樣本體積不足3 ml，用PBS 補(bǔ)充至3 ml,。 2. 加入6 ml Buffer VL,，蓋緊離心管帽，旋渦振蕩1 min,。 3. 加入6 ml Buffer G-B,，再次蓋緊離心管帽，立刻上下混勻,。 【兩相分離去除蛋白和其它雜質(zhì)】 4. 加入12 ml Buffer DV（4℃預(yù)冷）,，用力混合均勻。≥5 000×g 離心5 min,。 * 請(qǐng)?jiān)趯?shí)驗(yàn)前按實(shí)驗(yàn)準(zhǔn)備中提供的方法準(zhǔn)備Buffer DV,。 5. 盡可能吸盡藍(lán)色上相，保留相間沉淀和下相,。加入12 ml,，4℃預(yù)冷Buffer DV，用力混合,，≥5 000×g 離心5 min,。 【基因組DNA 的純化】 6. 丟棄上相，將下相轉(zhuǎn)移至中量濾器中（濾器置于另一50 ml 離心管中）,，將活塞插入注射器,，緩慢推動(dòng)活塞，收集50 ml 離心管中的濾液,。 * 上相必須*棄盡,。 * 如在轉(zhuǎn)移過(guò)程中下相沒有任何界面沉淀，步驟6 可以省略,。 7. 棄濾器,，在濾液中加入6 ml Buffer BV，混合均勻,。 8. 將連結(jié)管插到負(fù)壓裝置的插口上,，再將DNA 中量制備管插到連結(jié)管上,。將步驟7 的混合液移到制備管中，開啟并調(diào)節(jié)負(fù)壓裝置至-20-30 英寸汞柱,，吸盡管中液體,。 9. 保持負(fù)壓，加入8 ml Buffer W1,，吸盡管中液體,。 10. 保持負(fù)壓，加入9 ml 已加入乙醇的Buffer W2,，吸盡管中液體,。 * 確認(rèn)在Buffer W2 concentrate 中已按試劑瓶上的體積加入無(wú)水乙醇。 11. 用塑料扳手將中量制備管中的DNA 結(jié)合部分從負(fù)壓裝置轉(zhuǎn)移至另一潔凈的1.5 ml 離心管中,，加入0.3 ml Buffer W2,，蓋上中量制備管蓋后，12 000×g 離心2 min,。 12. 將DNA 結(jié)合部分置于另一潔凈的1.5 ml 離心管中,，在silica 膜中央加0.5 ml Eluent 或去離子水，蓋上中量制備管蓋后,，室溫靜置2 min,，12 000×g 離心1 min 洗脫DNA。 * 將去離子水或Eluent 加熱至65℃將提高洗脫效率,。 13. 可選步驟：同樣方法,，在silica 膜中央加0.25 ml Eluent 或去離子水，蓋上中量制備管蓋后,，室溫靜置1 min,，12 000×g 離心1 min 洗脫DNA。 |
| 注意事項(xiàng) | 1. Buffer VL,，Buffer BV 和Buffer W1 含刺激性化合物,，操作時(shí)要戴乳膠手套和眼鏡，避免沾染皮膚,、眼睛和衣服,，謹(jǐn)防吸入口鼻。若沾染皮膚,、眼睛時(shí),，要立即用大量清水和生理鹽水沖洗，必要時(shí)尋求醫(yī)療咨詢,。 2. 在按照此說(shuō)明書操作前,，請(qǐng)確保已做好足夠的對(duì)血傳播病毒的防護(hù)工作，按照正確方法處理體液和感染源。 3. 操作時(shí)嚴(yán)格按操作步驟進(jìn)行,，廢物必須放入含消毒液的廢物缸,，并高壓滅菌 |
