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實(shí)驗(yàn)步驟
1. 所有容器高溫滅菌兩次，DEPC高溫滅菌,，所有的試劑用DEPC配制,，高溫滅菌。
2. 在一滅菌2mL管中加入：5mol/L異硫氰酸胍0.7mL,、苯酚0.4mL,、NaAc(pH4.0) 0.1mL。
3. 稱取0.2g小麥黃化苗的葉片,，迅速在液氮中研磨成粉末,，轉(zhuǎn)入已準(zhǔn)備好的離心管中，劇烈震蕩。
4. 混勻,，冰浴30min,。
5. 4℃，12000rpm,，10min,。
6. 上清至另一離心管中加0.4mL氯仿，劇烈震蕩,。冰浴放置5min,。
7. 4℃，12000rpm,，10min,。
8. 棄有機(jī)相(下層) 加入0.4mL氯仿和0.4mL酚，室溫放置5min,。
9. 4℃,，12000rpm，10min,，棄有機(jī)相,，加入等體積異丙醇。-20℃放置1h,。
10. 4℃,，12000rpm，10min,，沉淀用70%乙醇洗兩次,。
11. 室溫稍干燥。
12. 沉淀加20μLDEPC水溶解(-20℃保存)
13. RNA電泳：1％瓊脂糖膠20mL,，8μL樣品,，1μL樣品緩沖液，1μLSYBR,，100V恒壓電泳，測OD260和OD260／OD280,。
注意事項(xiàng)
1. 步驟1目的是去除RNA酶(外源)的影響,。高溫滅菌兩次可以破壞RNA酶的復(fù)性過程，雖然RNA酶極易復(fù)性,，但兩次連續(xù)的高溫會打亂它的復(fù)性歷程,，從而使RNA酶失活。 DEPC是RNA酶的非競爭性抑制劑,。DEPC可以與RNA酶的活性中心的組氨酸咪脞環(huán)上的N結(jié)合,，從而使RNA酶失活。因?yàn)镈EPC能與RNA的N結(jié)合，從而修飾RNA,，所以必須將DEPCzui終除去,。在高溫滅菌時(shí)，DEPC因高溫分解而揮發(fā),。UV也能修飾RNA,，實(shí)驗(yàn)時(shí)應(yīng)避免。DEPC滅菌后稱為DEPC水,，它是不含DEPC的,。實(shí)驗(yàn)過程中要勤換手套，必要時(shí)要在超凈工作臺中進(jìn)行,。
2. 必須提前準(zhǔn)備好變性劑,。異硫氰酸胍可以變性RNA酶，也可以破細(xì)胞,。本試驗(yàn)不可以用酶法破細(xì)胞,。因?yàn)榈鞍酌窴的適合的條件也可以使RNA酶有活性。 NaAc酸性可以使DNA在有機(jī)相(酚相)中,，而在堿性條件下,，DNA和RNA都在水相中，無法分離,。苯酚用于抽提DNA和蛋白質(zhì),。
3. 低溫防止內(nèi)源性RNA酶降解RNA。劇烈震蕩是使所有的細(xì)胞散開,，浸在變性劑中,。低溫的細(xì)胞在相對高溫的液體中是會形成一團(tuán)，這樣就會使內(nèi)部的RNA沒有水解RNA的機(jī)會,。小麥的黃化苗因?yàn)闆]有光合作用,，所以含糖少，易于抽提,。
4. 步驟6目的是去除脂類,。
5. 步驟8目的是去除脂類和蛋白質(zhì)。
6. 步驟9目的是去除糖,，脫水,，因?yàn)轶w系高鹽(2mol/L NaAc)，所以可以使RNA沉淀,。
7. 步驟10注意因?yàn)樘岢龅牧亢苌?，可能不可見，所以離心要有方向標(biāo)記,。
8. RNA是非常不好溶解的,，所以只能稍干燥,。若不溶解是因?yàn)橛刑嗟奶堑臍堄唷?/p>
9. DEPC水中應(yīng)不含RNA酶。
