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實(shí)驗(yàn)試劑
膠原酶V,，512 kut/mg(Sigma公司)，DNA酶(Sigma公司),，胎牛血清(Gibco公司),，RPMI1640培養(yǎng)液(Gibco公司)，Dextran(Pharmacia公司),，Hanks平衡鹽溶液(Gibco公司)。
實(shí)驗(yàn)設(shè)備
離心機(jī),，注射器,，顯微鏡，超凈工作臺(tái)等,。
實(shí)驗(yàn)材料
成年雜種豬,，豬齡12 mo，體質(zhì)量150 kg左右,，豬被屠宰放血后,，在相對(duì)無菌條件下迅速取出胰腺，保存于4℃ Hanks液中送至實(shí)驗(yàn)室,，熱缺血時(shí)間少于10 min,，冷缺血時(shí)間少于90 min。
實(shí)驗(yàn)步驟
1. 胰島分離
胰腺取回后,，置于超凈工作臺(tái)上,，快速去除胰周組織、脂肪,、血管及外科被膜,，保留固有被膜。從胰頭,、胰體交界部橫斷胰腺,，找到主胰管，用20 G套管針插入,，縫合線結(jié)扎,，尾部遠(yuǎn)端亦結(jié)扎切斷，每次均取約15-20 g組織,，注入4℃含Ca2 Hanks液配制的復(fù)合膠原酶溶液(1.5 g/L,，內(nèi)含DNA酶0.3 g/L)，注入量 = 胰質(zhì)量×2，注射速度7 mL/min,，3-4 min內(nèi)完成,，置入玻璃容器內(nèi)，在38.5±0.1℃水浴中震蕩消化,，震速100 r/min,，在消化過程中間斷加入0.1 mmol/L的NaOH，使消化液pH值盡可能維持在7.8左右,，從消化20 min開始每間隔4 min取樣一次,，雙硫腙染色鏡檢，當(dāng)胰腺組織被消化裂解成細(xì)沙狀,，鏡檢見大部分結(jié)構(gòu)完整的胰島從外分泌組織中脫落出來,，立即用4℃冷Hanks液(含100 mL/L胎牛血清)終止消化，充分混勻后,，用40目鋼網(wǎng)過濾,，收集消化后組織，4℃離心冼滌2次,，去除脂肪等雜質(zhì)細(xì)胞,，取樣鏡檢計(jì)數(shù)和觀察消化后胰島分離情況。
2. 胰島純化
用Dextran配制成密度為1.037,，1.054,，1.070，1.096,，1.11 kg/L的不連續(xù)密度梯度液,，依次將不連續(xù)密度梯度液各10 mL加入50 mL離心管中，zui后將洗滌后的消化組織每0.5 mL與1.037 kg/L密度梯度液10 mL混勻,，小心移至離心管中液體上層,，形成不連續(xù)密度梯度。將2-4個(gè)離心管置入低溫離心機(jī)中,，先800 r/min離心5 min,，然后2 500 r/min離心15 min，離心后在1.096-1.054 kg/L之間收集純化的胰島,，4℃離心洗滌2次,。分別取樣鏡檢計(jì)數(shù)，估計(jì)純度和行生物學(xué)活性及組織學(xué)鑒定,。
3. 胰島計(jì)數(shù)和純度測(cè)定
分離純化后的組織懸液用雙硫腙(雙硫腙10 mg,，無水乙醇3 mL，250 g/L氨水50 mL)進(jìn)行染色,，光鏡下胰島細(xì)胞團(tuán)染成腥紅色或紅色,，外分泌組織不著色,，呈圓形、橢圓形或不規(guī)則形.在顯微鏡下計(jì)數(shù)直徑≥50 mm的胰島算出每克胰腺組織分離的胰島當(dāng)量數(shù),，純度用內(nèi),、外分泌組織量的比值來估計(jì)。
4. 胰島生物學(xué)活性鑒定
將純化后胰島細(xì)胞懸液放置在顯微鏡下,，用巴氏吸管吸取胰島放入培養(yǎng)板中,，每10個(gè)胰島當(dāng)量(每1個(gè)胰島當(dāng)量相當(dāng)于直徑150 mm的胰島細(xì)胞團(tuán)，IE)的成年豬胰島(APIs)置入一個(gè)培養(yǎng)孔,，6孔為1組,，共4組.每組分別置入無糖培養(yǎng)基、含5.6 mmoL/L葡萄糖(低糖),、16.7 mmoL/L葡萄糖(高糖),、16.7 mmoL/L葡萄糖加10 mmoL/L茶堿(高糖 茶堿)的RPMI1640培養(yǎng)液中，置于37℃,、含50 mL/L CO2的培養(yǎng)箱中孵育4 h,，收集培養(yǎng)液，用胰島素放免試劑盒(中科院原子能研究所)測(cè)定胰島素含量.
5. 胰島組織學(xué)檢查
離心純化后胰島細(xì)胞懸液,，收集胰島組織，用*固定,，石蠟包埋切片,，HE染色檢查胰島組織結(jié)構(gòu)完整性。
6. 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理
所得數(shù)據(jù)以mean±SD表示,，組間均數(shù)差異用t檢驗(yàn)比較,，P<0.05為有差異。
