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實(shí)驗(yàn)試劑
1. 75%酒精
2. 5% FCS-RPMI-1640*培養(yǎng)液與RPMI-1640*培養(yǎng)液
3. ConA或PHA
4. IL-1標(biāo)準(zhǔn)品：倍比稀釋成至少6個(gè)不同濃度值,。
實(shí)驗(yàn)設(shè)備
1. 3H-TdR、β-液閃汁數(shù)儀,，微量細(xì)胞收集儀
2. 解剖刀、剪,、單皿,、研磨工具(玻璃勻漿器,，不誘鋼網(wǎng)或者毛玻璃片,，用于研磨小鼠胸腺)
3. 96孔細(xì)胞培養(yǎng)板
4. 刻度吸管,，毛細(xì)吸管，刻度離心管、離心機(jī),、細(xì)胞計(jì)數(shù)板,，倒置顯微鏡，加樣器(頭),，50%CO2培養(yǎng)箱,，超凈工作臺(tái)
實(shí)驗(yàn)材料
1. 小鼠：BALB/C或C57BL/6小鼠，6-10周齡,，雌雄均可,。
2. IL-1待測樣品：倍比稀釋成至少6個(gè)不同濃度值,。
實(shí)驗(yàn)步驟
1. 準(zhǔn)備工作與ConA或PHA亞適劑量的確定
測定樣品前必須作ConA或PHA的劑量曲線,，觀察其對小鼠胸腺細(xì)胞增殖的影響，選擇一個(gè)既能夠激活胸腺細(xì)胞,，但又不引起其明顯增殖的合適劑量,，即亞適劑量。
1) 在96孔培養(yǎng)板各孔中加入小鼠胸腺細(xì)胞,，100μl/孔,；
2) 加入不同濃度的ConA(或PHA)，100μl/孔,，使其終濃度分別為0.5μg/ml,，1μg/ml ，2μg/ml,，5μg/ml,，10μg/ml，各設(shè)三復(fù)孔,，以不加ConA的培養(yǎng)液作對照,；
3) 置37℃，5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)72h,，收獲前12h加入3H-TdR,，0.5μci/50μl/孔；
4) 用微量細(xì)胞收集儀收集細(xì)胞于玻璃纖維紙上,，用β-液閃計(jì)數(shù)儀測定各孔cpm值,；數(shù)據(jù)(cpm)以三個(gè)復(fù)孔平均值 標(biāo)準(zhǔn)差表示，
5) 數(shù)據(jù)(cpm)以三個(gè)復(fù)孔平均值 標(biāo)準(zhǔn)差表示,，繪制ConA劑量曲線,，據(jù)此選擇亞適劑量，通常為0.2-2.0μg/ml)(終濃度),；
2. 操作步驟
1) 拉頸處死小鼠,，浸泡于75%酒精中3-5min，消毒處理；
2) 無菌操作取出小鼠胸腺,，放入含有RPMI-1640*培養(yǎng)液的平皿中,；
3) 將胸腺剪碎(或研磨工具磨碎)，無菌紗布過濾,，制成單個(gè)胸腺細(xì)胞懸液,；
4) 用PRMI-1640*培養(yǎng)液洗滌上述細(xì)胞2次，1500r/min離心10min,，然后用5% FCS-RPMI-1640*培養(yǎng)液調(diào)細(xì)胞濃度為1.5×107/ml,；
5) 在96孔培養(yǎng)板各孔中加入小鼠胸腺細(xì)胞，100μl/孔,；
6) 將倍比稀釋后的標(biāo)準(zhǔn)品與待測樣品加到上述各孔中,，100μl/孔，一式3份,，設(shè)培養(yǎng)液對照及有絲分裂原對照,。
7) 將預(yù)先確定的亞適劑量的ConA(終濃度約0.2~2.0μg/ml)或PHA(終濃度為約0.5~4.0μg/ml)加入96孔培養(yǎng)板中，100μl/孔,。
8) 置37℃,，5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)72h，收集*-12h加入3H-TdR 0.5uci/50ul/孔,。
9) 用微量細(xì)胞收集儀收集細(xì)胞于玻璃纖維紙上,，用β液閃計(jì)數(shù)儀測定各孔3H-TdR摻入量(cpm值)。
注意事項(xiàng)
1. 所制備的小鼠胸腺細(xì)胞存活率應(yīng)>95%,。
2. 標(biāo)準(zhǔn)品及待測樣品應(yīng)以1:2開始至少6個(gè)倍比稀釋度,。
3. 加樣時(shí)，應(yīng)以低濃度到高濃度順序加入,，且不可共用加樣器頭,。
4. 由于受其他細(xì)胞因子的影響，本法特異性受到一定限制,。
5. 亦可用D10G4.1細(xì)胞(小鼠T輔助細(xì)胞克隆)代替上述小鼠胸腺細(xì)胞進(jìn)行IL-1生物活性檢測,，基本方法相同。但由于D10G4.1細(xì)胞對IL-1的敏感性大大增強(qiáng),，而對IL-2相對不敏感,，且對IL-1的敏感性比對IL-2的敏感性大100~1000倍，故本法敏感性與特異性均較小鼠胸腺細(xì)胞增殖法,。
