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PCR法是20世紀80年代中期建立起來的一種體外DNA擴增技術，其基本原理是酶促DNA合成反應,，即在DNA模板,、引物和脫氧核糖核酸存在下,，經(jīng)DNA聚合酶的作用,，使DNA 鏈擴增延伸,。該方法具有靈敏度高,、特異性強,、快速的特點，但其對實驗環(huán)境的要求嚴格,，實驗成本較高,，有時還有假陽性的現(xiàn)象出現(xiàn)。
1,、儀器設備
超凈工作臺,、PCR儀、電泳儀,、凝膠成像分析系統(tǒng),、臺式離心機、旋渦混懸器等。
2,、實驗試劑
選用美國Stratagene公司生產(chǎn)的支原體檢測試劑盒（內(nèi)有引物,、陽性對照、內(nèi)對照,、StrataClean resin,、緩沖液），dNTP,，TapDNA聚合酶,，緩沖液，瓊脂糖,，礦物油,。
3、實驗操作
PCR反應的前期操作應在無菌環(huán)境中進行,。
（1）樣品的收集：待測細胞用抗培養(yǎng)基培養(yǎng)7d,，用無菌容器取上清液500ul，4℃保存待測,。
（2）模板的制作：在無菌的條件下,，取細胞培養(yǎng)上清100ul于一無菌的0.5ml塑料離心管內(nèi)，蓋好蓋子,，95℃水浴加熱5min,。
（3）打開蓋子，向管內(nèi)加StrataClean resin10ul,，蓋好蓋子,，旋渦混懸器混合，離心5—10s,，吸取上清至一新的塑料離心管中,，模板制作完畢，4℃保存,。
（4）PCR反應：反應體系zui適條件為：10mmol/lTris-HCL（pH8.38）,；50mmol/lHCL；1.5-2.5mmol/lMgCL2,；200umol/ldNTP,；2UDapDNA聚合酶?？偡磻w系為50ul,，反應用去離子水均需用12000uw/cm2紫外燈照射。反應如下表：
表 反應程序
| 程 序 | 循 環(huán) | 溫度/℃ | 時間/min |
| 94 | 2 | ||
| 1 | 1 | 50 | 2 |
| 72 | 2 | ||
| 94 | 1 | ||
| 2 | 40 | 50 | 1 |
| 72 | 2 |
①在0.5ml塑料離心管中加入35.2ul去離子水及5ul*10Taq反應緩沖液,。
②依次加入下列成分：0.4uldNTPs（25mmol/l）,，0.4ulTaqDNA聚合酶（5U/ul）,，2ul引物。
③加2ul去離子水,，總體積45ul,。
④加2ul已制成的模板到反應體系中。
⑤陽性對照,，內(nèi)對照各5ul加入到各自的反應體系中,。
⑥取一支含有以上反應體系的離心管，加入5ul去離子水作為陰性對照管,。
⑦在反應體系中加入100ul礦物油,。
（5）瓊脂糖凝膠電泳：PCR反應結束后，進行瓊脂糖凝膠電泳,，瓊脂糖凝膠濃度2%,。電泳結束后，凝膠成像分析結果,。
（6）結果分析：該方法為檢測支原體的定性方法,，在電泳泳道上，MARKER,、陽性對照,、內(nèi)對照均會出現(xiàn)不同的電泳條帶，當被檢樣品泳道出現(xiàn)明亮條帶,，且位置在陽性對照和陰性對照條帶位置之間,，即可認為該樣品被支原體污染。有時還會發(fā)現(xiàn)一條泳道出現(xiàn)多條,，可能是該樣品感染兩種以上支原體所致,。如果泳道內(nèi)條帶隱約出現(xiàn)，則可懷疑有支原體污染,，重做該樣品,。
