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實(shí)驗(yàn)器材
手術(shù)小直剪刀三把,、眼科直鑷子三把,、眼科彎鑷子兩把,、玻璃平 皿三套,、200目尼龍濾網(wǎng),、50ML、15ML離心管和手術(shù)刀片,。以上物品均需要高壓滅菌消毒處理,。
實(shí)驗(yàn)試劑
無(wú)Ca2+和Mg2+的 PBS、0.05%胰酶0.53mmol/L EDTA溶液,、小鼠胚成纖維細(xì)胞（MEF）生長(zhǎng)培養(yǎng)基：高糖DMEM加10%FCS,。
實(shí)驗(yàn)動(dòng)物
孕期14至16天的孕鼠
實(shí)驗(yàn)步驟
1. 處死孕鼠，置于75%酒精里全身浸泡,，然后在超凈臺(tái)中用一把剪刀和一把鑷子把孕鼠外皮剪開(kāi),，用另外一把剪刀和一把鑷子把內(nèi)皮剪開(kāi)，露出子宮,，zui后用第三把剪刀和鑷子將子宮小心取出放在盛有PBS的玻璃平皿中,，沖洗去血。
2.用兩把彎鑷子將胚胎外的胞膜小心去除,，然后夾掉頭和內(nèi)臟,，將其余胚胎轉(zhuǎn)移到一個(gè)裝有30MLPBS的50ML離心管中，輕輕顛倒兩次，倒掉PBS,，再重復(fù)此步驟一次,，留少許PBS將胚胎轉(zhuǎn)移到另一裝有PBS的平皿中，用手術(shù)刀片將其細(xì)細(xì)切碎,。
3.用200ul的移液槍反復(fù)快速吹打平皿中的液體,，放在15ML離心管中，4℃1500rpm離心5分鐘,，倒掉上清,，加10ML胰酶，重懸沉淀,，放37℃水浴中消化30分鐘,，且每隔五分鐘輕輕晃動(dòng)，使之充分消化,。
4.將上層細(xì)胞懸液倒入一裝有 10MLMEF生長(zhǎng)培養(yǎng)基的50ML離心管中,，用200目尼龍濾網(wǎng)過(guò)濾后，1500rpm離心5分鐘收集細(xì)胞,。30ML MEF生長(zhǎng)培養(yǎng)基洗滌兩次（此步驟中作者試過(guò)用無(wú)血清的培養(yǎng)基洗滌,，結(jié)果無(wú)差別）。
5.細(xì)胞沉淀用15ML生長(zhǎng)培養(yǎng)基懸起,，細(xì)胞計(jì)數(shù)（八只14天胎鼠可獲得2-3×107細(xì)胞）,。
6.3×106細(xì)胞懸浮于15ML MEF生長(zhǎng)培養(yǎng)基中，接種到200ML的培養(yǎng)瓶中,。
7.24小時(shí)后更換新鮮的MEF生長(zhǎng)培養(yǎng)基,。
8.細(xì)胞長(zhǎng)滿后，先用PBS沖洗,，倒掉,，加胰酶消化（此步時(shí)間不宜過(guò)長(zhǎng)，作者一般不超過(guò)五分鐘）,，按1：5傳代,。
9.細(xì)胞再次長(zhǎng)到覆蓋率80-90%左右，將其消化后,，常規(guī)凍存,。（凍存液要現(xiàn)配）
五、討論
1.原代培養(yǎng),，一定要避免污染,。
2. MEF生存能力有限，如果不凍存,，體外存活十代左右,。
3. 凍存后復(fù)蘇的細(xì)胞只能傳代一次,，因?yàn)檫@些細(xì)胞繁殖能力有限。
4. 消化細(xì)胞時(shí)間不要過(guò)長(zhǎng),。
