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實驗器材
手術(shù)小直剪刀三把,、眼科直鑷子三把,、眼科彎鑷子兩把,、玻璃平 皿三套、200目尼龍濾網(wǎng),、50ML,、15ML離心管和手術(shù)刀片。以上物品均需要高壓滅菌消毒處理,。
實驗試劑
無Ca2+和Mg2+的 PBS,、0.05%胰酶0.53mmol/L EDTA溶液、小鼠胚成纖維細胞（MEF）生長培養(yǎng)基：高糖DMEM加10%FCS。
實驗動物
孕期14至16天的孕鼠
實驗步驟
1. 處死孕鼠,，置于75%酒精里全身浸泡,，然后在超凈臺中用一把剪刀和一把鑷子把孕鼠外皮剪開，用另外一把剪刀和一把鑷子把內(nèi)皮剪開,，露出子宮，zui后用第三把剪刀和鑷子將子宮小心取出放在盛有PBS的玻璃平皿中,，沖洗去血,。
2.用兩把彎鑷子將胚胎外的胞膜小心去除，然后夾掉頭和內(nèi)臟,，將其余胚胎轉(zhuǎn)移到一個裝有30MLPBS的50ML離心管中,，輕輕顛倒兩次，倒掉PBS,，再重復此步驟一次,，留少許PBS將胚胎轉(zhuǎn)移到另一裝有PBS的平皿中，用手術(shù)刀片將其細細切碎,。
3.用200ul的移液槍反復快速吹打平皿中的液體,，放在15ML離心管中，4℃1500rpm離心5分鐘,，倒掉上清,，加10ML胰酶，重懸沉淀,，放37℃水浴中消化30分鐘,，且每隔五分鐘輕輕晃動，使之充分消化,。
4.將上層細胞懸液倒入一裝有 10MLMEF生長培養(yǎng)基的50ML離心管中,，用200目尼龍濾網(wǎng)過濾后，1500rpm離心5分鐘收集細胞,。30ML MEF生長培養(yǎng)基洗滌兩次（此步驟中作者試過用無血清的培養(yǎng)基洗滌,，結(jié)果無差別）。
5.細胞沉淀用15ML生長培養(yǎng)基懸起,，細胞計數(shù)（八只14天胎鼠可獲得2-3×107細胞）,。
6.3×106細胞懸浮于15ML MEF生長培養(yǎng)基中，接種到200ML的培養(yǎng)瓶中,。
7.24小時后更換新鮮的MEF生長培養(yǎng)基,。
8.細胞長滿后，先用PBS沖洗,，倒掉,，加胰酶消化（此步時間不宜過長，作者一般不超過五分鐘），按1：5傳代,。
9.細胞再次長到覆蓋率80-90%左右,，將其消化后，常規(guī)凍存,。（凍存液要現(xiàn)配）
五,、討論
1.原代培養(yǎng)，一定要避免污染,。
2. MEF生存能力有限,，如果不凍存，體外存活十代左右,。
3. 凍存后復蘇的細胞只能傳代一次,，因為這些細胞繁殖能力有限。
4. 消化細胞時間不要過長,。
