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1、實驗原理
帶有特異抗原的靶細(xì)胞（如正常細(xì)胞,、腫瘤細(xì)胞,、病毒感染細(xì)胞）與相應(yīng)抗體結(jié)合后，在補體的參與下,，引起靶細(xì)胞膜損傷,，導(dǎo)致細(xì)胞膜的通透性增加、細(xì)胞死亡,。染料（例如：伊紅-Y,、臺盼藍(lán)）可通過細(xì)胞膜進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)使細(xì)胞著色，故可用于指示死細(xì)胞或瀕死細(xì)胞,，而活細(xì)胞不著色,。此即補體依賴性細(xì)胞毒試驗，利用細(xì)胞毒試驗可以檢查細(xì)胞膜抗原,，亦可鑒定抗體的特異性,。
本實驗中，Thy-1抗原是小鼠胸腺T細(xì)胞特異的表面抗原,，在體外利用抗小鼠Thy-1的單克隆抗體通過補體的協(xié)同作用,，可殺傷95％以上的胸腺細(xì)胞。
2,、實驗材料
（1）解剖器械(眼科剪,、眼科鑷),、平皿、80～100目不銹鋼網(wǎng),；
（2）試管,、lml吸量管、尖吸管,；
（3）載玻片,、蓋玻片；
（4）C57BL／6J小鼠,；
（5）含5％NBS的冷Hank’s液,；
（6）抗小鼠Thy-1的單克隆抗體（zui適稀釋度，本室制備）,；
（7）補體(豚鼠新鮮血清并經(jīng)小鼠胸腺細(xì)胞吸收，預(yù)先測定效價并稀釋為*稀釋度),；
（8）1%伊紅-Y染液,。
3、實驗方法
（1）小鼠胸腺細(xì)胞懸液的制備：將4～6周齡小鼠采用頸椎脫臼法處死,，取出胸腺放入已加入約4ml冷Hank’s液的平皿中,，在100目的不銹鋼網(wǎng)上研磨后，過篩,，放入試管,，離心1000rpm，5分鐘,，用Hank’s液洗兩次,。將沉淀的細(xì)胞重懸于Hank’s液中，配成1×107／ml細(xì)胞懸液,。
（2）取試管3支,，標(biāo)明順序，依據(jù)下表依次加入1×107/ml胸腺細(xì)胞懸液,、抗小鼠Thy-1的單克隆抗體(zui適稀釋度)及Hank’s液,，放入37℃水浴30分鐘。
| 實驗材料 | 試驗管 | 補體對照管 | 細(xì)胞對照管 |
| 1×107/ml胸腺細(xì)胞懸液 | 0.1ml | 0.1ml | 0.1ml |
| Thy-1單克隆抗體 | 0.1ml | —— | —— |
| Hank’s液 | —— | 0.1ml | 0.2ml |
| 1：3補體 | 0.1ml | 0.1ml | —— |
（3）取出后每管加入1%伊紅-Y染液1滴,，混勻,，室溫放置2分鐘。
（4）重新混勻后分別在一張載玻片上滴片,，加蓋玻片鏡檢,。先在低倍鏡下觀察，再用高倍鏡觀察,，比較3管中細(xì)胞死活情況,。
4,、實驗結(jié)果
死細(xì)胞呈紅色，無光澤且腫脹變大,；活細(xì)胞不著色,、有光澤且形態(tài)正常。
高倍鏡下計數(shù)200個細(xì)胞并計算其中死細(xì)胞的百分?jǐn)?shù),。計算公式如下：死細(xì)胞百分?jǐn)?shù)= EQ EQ \F(實驗管死細(xì)胞數(shù)%-對照管死細(xì)胞數(shù)%,100%-對照管死細(xì)胞數(shù)%)
5,、注意事項
（1）胸腺細(xì)胞制備速度要快，且需在冰浴中進(jìn)行操作,，以保持細(xì)胞活力,；
（2）抗Thy-1的單克隆抗體和補體的效價要在預(yù)實驗中確定；
（3）細(xì)胞對照管死細(xì)胞數(shù)若超過5%,，實驗需重新做,；
（4）細(xì)胞滴加到載玻片上后長時間放置不檢測也可導(dǎo)致假陽性反應(yīng)。
