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1,、石蠟切片置于67℃烘箱中,烘片2小時,,脫蠟至水,,用pH7.4的PBS沖洗三次,每次3分鐘(3×3’),。
2,、取一定量pH=6.0檸檬酸鹽緩沖液,加入微波盒中,,微波加熱至沸騰,,將脫蠟水化后的組織切片置于耐高溫塑料切片架上,放入已沸騰的緩沖液中,,中檔微波處理10分鐘,,取出微波盒流水自然泠卻,從緩沖液中取出玻片,,先用蒸餾水沖洗兩次,之后用PBS沖洗2×3’,。(注:不是所有的抗體都需要微波修復的,,視具體情況而定)
3、每張切片加1滴3%H2O2,,室溫下孵育10分鐘,,以阻斷內源性過氧化物酶的活性。PBS沖洗3×3’,。
4,、除去PBS液,每張切片加1滴相應的*抗體(相應稀釋倍數),,室溫下孵育2小時,。
5,、PBS沖洗3×5’。除去PBS液,,每張切片加1滴聚合物增強劑,,室溫下孵育20分鐘。PBS沖洗3×3’,。
6,、除去PBS液,每張切片加1滴酶標抗鼠/兔聚合物,,室溫下孵育30分鐘,。PBS沖洗3×5’。
7,、除去PBS液,,每張切片加1滴新鮮配制的DAB液(二氨基聯(lián)苯胺),顯微鏡下觀察5分鐘,。
8,、蘇木素復染,0.1%HCl分化,,自來水沖洗,,藍化,切片經梯度酒精脫水干燥,,二甲苯透明,,中性樹膠封固,晾干后觀察,。