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DMEM Ⅱ型膠原酶 α-平滑肌肌動蛋白抗體 胎牛血清 胰蛋白酶 D-Hanks’液

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一,、實(shí)驗(yàn)方法

1. 膀胱平滑肌細(xì)胞酶法分離

（1）肌注鹽200 mg 及氟哌利多5 mg 麻醉,，待兔進(jìn)入麻醉狀態(tài)后消毒，下腹正中切口,，迅速切取膀胱組織,。

（2）超凈臺內(nèi)依次慶大霉素溶液(濃度為100 單位/毫升)、生理鹽水及D-Hanks’液中浸泡洗滌 5 分鐘,，然后放入D-Hanks液中除去黏膜,、黏膜下及漿膜層。

（3）肌肉剪成肉糜后0.1%Ⅱ型膠原酶(2 mg/mL) 溶液 40 過消化(約10-12 小時(shí)),。

（4）然后加 0.25%胰蛋白酶 370 消化30 分鐘,，消化液變混濁呈絮狀提示消化良好。

（5）用100 目細(xì)胞篩過濾該絮狀液,，混懸液離心(1000  轉(zhuǎn)/分,，離心半徑 13 cm) 5 分鐘，沉淀的細(xì)胞移入培養(yǎng)皿,，加入含 10%胎牛血清的DMEM,，置于50 mL/L CO₂、37℃飽和濕度孵育箱中靜置培養(yǎng),， 培養(yǎng)液每周更換 2-3 次,。

2. 傳代培養(yǎng)

（1）待培養(yǎng)的細(xì)胞通過增殖達(dá)到約 80%匯合狀態(tài)時(shí)做傳代處理。

（2）棄去原培養(yǎng)瓶中的舊培養(yǎng)液,，加入適量 的PBS(因培養(yǎng)液中的胎牛血清對胰蛋白酶有抑制作用),，輕輕搖動，清洗殘留的培養(yǎng)液后棄之,。

（3）加入適量的消化液,，使其覆蓋整個(gè)細(xì)胞，將培養(yǎng)瓶放置于CO₂培養(yǎng)箱,，不時(shí)在倒置顯微鏡下觀察,，當(dāng)細(xì)胞胞質(zhì)回 縮,，胞間間隙增大后，吸出消化液,，并向培養(yǎng)瓶中加入含10%胎牛血清的培養(yǎng)液終止消化,。

（4）用吸管吸取培養(yǎng)瓶中的培養(yǎng)液，反復(fù)吹打瓶壁制備細(xì)胞懸液,，吹打時(shí)不能用力過猛,，盡量不出現(xiàn)氣泡，以免損傷細(xì)胞,。

（5）細(xì)胞進(jìn)行計(jì)數(shù)后,，按照 1X10⁵~10⁶細(xì)胞/mL 密度將細(xì)胞接種于培養(yǎng)瓶中。

3. 培養(yǎng)細(xì)胞的觀察及鑒定

兩只兔所有標(biāo)本均獲成功。倒置顯微鏡觀察平滑肌細(xì)胞24 小時(shí)均可見膀胱平滑肌細(xì)胞貼壁生長,，正常兔 7 天左右,、而梗阻兔則需10~12 天可于50 毫升培養(yǎng)瓶約 80%匯合。

均傳代順利,，傳代后約正常兔6天左右,、而梗阻兔需8~9 天可于50 毫升培養(yǎng)瓶約 80%匯合。

本組中均傳至第8 代,，經(jīng)第8 次傳代后,， 平滑肌細(xì)胞仍生長迅速，未見衰老跡象,。

倒置顯微鏡下觀察均呈“谷和峰”樣結(jié)構(gòu)(圖1 中對照組2 周的 細(xì)胞,；圖2 中實(shí)驗(yàn)組培養(yǎng)2 周的細(xì)胞)。

細(xì)胞爬片HE染色見膀胱平滑肌細(xì)胞細(xì)胞核呈兩端鈍圓的卵圓形平滑肌細(xì)胞核型(見圖 3),。

電鏡檢查可見平滑肌細(xì)胞密班結(jié)構(gòu)(圖 4),。

免疫組化染色檢測α-SMA 呈陽性反應(yīng)(圖 5)。

從細(xì)胞爬片HE染色和免疫組化染色檢測α-SMA 呈陽性反應(yīng)中我們發(fā)現(xiàn)該方法所的膀胱平滑肌細(xì)胞的純度幾乎99%,。
 

 圖1. 對照組2周的細(xì)胞
 

圖2. 實(shí)驗(yàn)組培養(yǎng)2周的細(xì)胞
 

 
圖 3. 細(xì)胞爬HE染色見膀胱平滑肌細(xì)胞 ,，細(xì)胞核呈兩端鈍圓的卵圓形平滑肌細(xì)胞核型

圖4. 分離后培養(yǎng)細(xì)胞的電鏡檢查發(fā)現(xiàn)，平滑肌細(xì)胞致密斑結(jié)構(gòu)
 

 圖5. α-SMA免疫組化證實(shí)該方法能獲得單一膀胱平滑肌細(xì)胞(棕色為α-SMA陽性) 
 

1. 應(yīng)嚴(yán)格無菌操作,。

2. 仔細(xì)*剝除膀胱黏膜,、黏膜下及漿膜層，是確保獲的大量高質(zhì)單個(gè)膀胱平滑肌細(xì)胞的基礎(chǔ)。

3. 膀胱平滑肌組織應(yīng)盡量減碎以確保充分消化,。

4. 嚴(yán)格控制膠原酶和胰蛋白酶的濃度和消化時(shí)間,，見消化液混濁、組織塊呈絮狀,，或在倒置顯微鏡下見消化液中有較多單個(gè)細(xì)胞或細(xì)胞小團(tuán)塊時(shí)即終止消化,。

5. 細(xì)胞篩的運(yùn)用也是獲得高質(zhì)單個(gè)膀胱平滑肌細(xì)胞的基礎(chǔ)。

平滑肌細(xì)胞的培養(yǎng)方法可分為兩類：組織塊法和酶消化法。組織塊法適用于細(xì)嫩,、易碎的組織,；其方法較簡單；但容易產(chǎn)生雜質(zhì)如成纖維細(xì)胞等,，成纖維細(xì)胞生長快,，故培養(yǎng)之細(xì)胞質(zhì)量較差；培養(yǎng)的大多數(shù)細(xì)胞無收縮性,；且原代細(xì)胞的獲得需 3-4 周,，獲得大量平滑肌細(xì)胞耗時(shí)長^[1]。既往酶消化法較組織塊法復(fù)雜,、精細(xì),；適宜的酶濃度和培養(yǎng)時(shí)間的確定較為困難；然而在較短時(shí)間內(nèi)可獲得大量的平滑肌細(xì)胞,，1996 年Chambers等^[2]報(bào)道酶消化法純度為70%,。可見一種快速,、,、高純度的酶消化法培養(yǎng)膀胱平滑肌的方法顯得尤為重要。

本實(shí)驗(yàn)研究兩只兔所有標(biāo)本均獲成功,。倒置顯微鏡觀察平滑肌細(xì)胞24 小時(shí)均可見膀胱平滑肌細(xì)胞貼壁生長,，正常兔7 天左右、而梗阻兔則需10~12 天可于50ml 培養(yǎng)瓶約 80%匯合,。

均傳代順利,，傳代后約正常兔6 天左右、而梗阻兔需8~9 天可于50 ml 培養(yǎng)瓶約80%匯合,。

本組中均傳至第8 代,，經(jīng)第8 次傳代后，平滑肌細(xì)胞仍生長迅速,，未見衰老跡象,。

倒置顯微鏡下觀察均呈“谷和峰”樣結(jié)構(gòu)。

細(xì)胞爬片HE染色見膀胱平滑肌細(xì)胞細(xì)胞核呈兩端鈍圓的卵圓形平滑肌細(xì)胞核型。

電鏡檢查可見平滑肌細(xì)胞密班結(jié)構(gòu),。免疫組化染色檢測α-SMA呈陽性反應(yīng),。

從細(xì)胞爬片HE染色和免疫組化染色檢測α-SMA呈陽性反應(yīng)中我們發(fā)現(xiàn)該方法所的膀胱平滑肌細(xì)胞的純度幾乎 99%(在以下的膀胱平滑肌細(xì)胞的共聚焦檢測中也證實(shí)了這一點(diǎn))。

膀胱平滑肌的鑒定^[3]主要根據(jù)其細(xì)胞形態(tài)及α-actin的檢測,。

倒置顯微鏡下觀察均呈“谷 和峰”樣結(jié)構(gòu),；細(xì)胞爬片HE染色見膀胱平滑肌細(xì)胞細(xì)胞核呈兩端鈍圓的卵圓形平滑肌細(xì)胞核型；電鏡檢查可見平滑肌細(xì)胞密班結(jié)構(gòu),，這些細(xì)胞形態(tài)學(xué)的檢測均證實(shí)其為膀胱平滑肌細(xì)胞,。

免疫組化染色檢測α-SMA呈陽性反應(yīng)更進(jìn)一步證實(shí)了該方法所獲得的細(xì)胞為膀胱平滑肌細(xì)胞。

梗阻后的膀胱平滑肌細(xì)胞在生長擴(kuò)增中明顯較正常膀胱平滑肌細(xì)胞 時(shí)間長,，說明了這種酶消化法對膀胱平滑肌細(xì)胞的影響不是太大,，還是保留著體內(nèi)的基本特性。

在我們的激光掃描共聚焦顯微鏡的檢測中平滑肌細(xì)胞內(nèi)的鈣離子熒光強(qiáng)度在M受體激動劑的影響下發(fā)生明顯變化,，這更進(jìn)一步證實(shí)了該方法分離培養(yǎng)出的膀胱平滑肌仍保持著收縮功能,。

1. Korkmaz M, Guvenc BH, Bilir A et al. Isolation and culture of adult and fetal rabbit bladder smooth muscle cells and their interaction with biopolymers. J Pediatr Surg, 2003,38(1):21-24.

2. Chambers P,Neal DE,Gillespie JI. Ca²⁺ signalling in cultured smooth muscle cells from human bladder.Exp Physiol,1996,81(4):553-564.

3. ChamLey   CJ,Campbell   GR,Ross   R.The   smooth   muscle   cells   in   culture. Physiol   Rev,1979,599(1):1-61.

4. Sui GP, Wu C, Fry CH .A description of Ca²⁺ channels in human detrusor smooth muscle. BJU Int,2003,92(4):476-478.

5. Sui GP, Wu C, Fry CH. The electrophysiological properties of cultured and freshly isolated detrusor smooth muscle cells. J Urol, 2001,165(2):627-632.