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標簽： 大鼠 腦微血管 內(nèi)皮細胞 原代培養(yǎng)
大鼠腦微血管內(nèi)皮細胞原代培養(yǎng)可以：（1）應用于血腦屏障的研究,；（2）腦血管疾病的病理生理及分子生物學研究,；（3）新藥篩選；（4）腦微血管內(nèi)皮細胞生理生化及藥理學研究,。
實驗方法
- 酶消化法
| 實驗方法原理 | 丁香園站友參考文獻采用以大腦皮質(zhì)為材料、酶消化及梯度離心分離腦微血管段并進行原代培養(yǎng),,，成功地摸索出大鼠腦微血管內(nèi)皮細胞分離和原代培養(yǎng)的方法,，并獲得純度較高的腦微血管內(nèi)皮細胞,。 |
|---|---|
| 實驗材料 | SD大鼠 |
| 試劑、試劑盒 | 纖連蛋白 Ⅳ型膠原 明膠 肝素鈉 堿性成纖維細胞生長因子 青霉素 鏈霉素 NaHCO3 牛血清白蛋白 鼠尾膠 葡聚糖 DNA酶I D-Hanks'液 II型膠原酶 |
| 儀器,、耗材 | 低溫離心機 離心管 移液槍 |
| 實驗步驟 | 一,、實驗材料準備 1. 實驗動物 每次實驗采用10只2-3周齡SD大鼠，雌雄均可,，體重40~60 g,。 纖連蛋白(fibronectin)、Ⅳ型膠原,、鼠尾膠,、葡聚糖(dextran，分子量100~200 kDa)和DNA酶I(DNase I)購自Sigma公司,；D-Hanks'液,、10×PBS按配方自制；II型膠原酶購自Worthington公司,；明膠,、牛血清白蛋白(BSA)、HEPES購自Amresco公司,；Percoll 購自Amersham Biosciences,；DMEM(高糖)購自GIBCO/BRL公司；肝素鈉,、NaHCO3購自中國醫(yī)藥集團上?；瘜W試劑公司；青,、鏈霉素購自上海生工生物工程有限公司,；胎牛血清(FBS)購自PAA Laboratories；堿性成纖維細胞生長因子(bFGF),，膠原酶/分散酶(collagenase/dispase)購自Roche公司,。 3. 儀器 低溫離心機(Centrifuge 5810 R，購自Eppendorf,；Himac CR 22F,，購自Hitachi)。 4. 試劑配制 （1）1 mg/ml鼠尾膠(用0.2%乙酸配制),，1%明膠(用D-Hanks'液配制),，1%II型膠原酶(用DMEM配制，用時稀釋成0.1%的濃度),，1%膠原酶/分散酶(用DMEM配制,，用時稀釋成0.1%)，15%葡聚糖(用PBS配制),，20% BSA(用DMEM配制,，調(diào)pH值至7.4后用0.45 μm濾膜過濾除菌，較難過濾),，DNase I(用冷PBS配制成2 U/μl)，以上試劑經(jīng)0.22 μm濾膜過濾除菌后分裝保存于-20℃,。 二,、培養(yǎng)皿預處理 1. 涂布3種不同的基質(zhì)，培養(yǎng)前一天加入1 ml 1%明膠于35 mm塑料培養(yǎng)皿,，置于37 ℃培養(yǎng)箱,，接種前用D-Hanks'液漂洗2次,。 三,、 腦微血管段的分離與腦微血管內(nèi)皮細胞原代培養(yǎng) 1. 大鼠頸椎脫臼處死后浸泡于75%乙醇中消毒3~5 min后斷頭置于玻璃培養(yǎng)皿中，打開顱腔后取出全腦置于盛有冷D-Hanks'液的玻璃培養(yǎng)皿中解剖去除小腦,、間腦(包括海馬),。
四,、鑒定方法 形態(tài)學、Ⅷ因子相關(guān)抗原免疫組織化學檢測,。 五,、 結(jié)果 1. 細胞形態(tài)觀察 接種當時可見由圓形的內(nèi)皮細胞構(gòu)成的呈單枝狀或分枝狀的腦微血管段，并可見散在的單細胞及組織碎片(見圖1-1),；培養(yǎng)12~24 h后可見培養(yǎng)的細胞從貼壁的微血管段周圍長出,，細胞呈短梭形，區(qū)域性單層生長,，經(jīng)換液后微血管段的殘余部分不斷減少,，成纖維細胞、周細胞等雜細胞含量較少,；隨著培養(yǎng)時間的延長,，內(nèi)皮細胞不斷增殖,，可見"漩渦"分布，大約5~7天細胞達到融合,，短梭形的內(nèi)皮細胞占90%以上，但可見少量周細胞等雜細胞生長于內(nèi)皮細胞單層表面或細胞克隆間隙(結(jié)果未顯示),。細胞生長過程見圖1,，細胞接種于纖連蛋白/Ⅳ型膠原涂布的培養(yǎng)皿。 2. 涂布不同基質(zhì)的細胞生長情況 明膠及鼠尾膠涂布的培養(yǎng)皿微血管段貼壁時間較長,，6 h時可見少量微血管段貼壁但無內(nèi)皮細胞長出,，12~24 h可見一些內(nèi)皮細胞長出，24 h后腦微血管段*貼壁并有較多的內(nèi)皮細胞長出,，兩者無明顯差異(見圖2-1~4),；纖連蛋白/Ⅳ型膠原涂布的培養(yǎng)皿培養(yǎng)后6 h即可見微血管段貼壁并有一些內(nèi)皮細胞長出，12~24 h內(nèi)基本*貼壁并有較多的內(nèi)皮細胞長出(見圖2-5,6),。 3. 免疫組化鑒定 Ⅷ因子相關(guān)抗原免疫組化檢測可見培養(yǎng)的腦微血管內(nèi)皮細胞的胞漿及核周有棕黃色著色,，胞核呈空泡狀結(jié)構(gòu)；對照染色為陰性,。 收起 |
| 其他 | 一,、實驗討論 我們采用兩次酶消化,、梯度離心分離得到腦微血管段,，探索各種不同的培養(yǎng)條件,，成功地進行了較純的大鼠腦微血管內(nèi)皮細胞的原代培養(yǎng)，內(nèi)皮細胞純度可達90%以上,，而且細胞得率較高，10只動物可培養(yǎng)8~10個35 mm一次性塑料培養(yǎng)皿,，培養(yǎng)面積大約80~100 cm2,，與國內(nèi)的一些方法[3~5]相比，細胞得率有明顯的提高,。 由于新生鼠易于混有較多的雜細胞且大腦較小以及哺乳期大鼠優(yōu)于超過1月齡的大鼠[9],，我們采用2~3- 12 - 丁香園細胞技術(shù)討論版電子文集 大鼠腦微血管內(nèi)皮細胞培養(yǎng)周齡哺乳期的SD大鼠作為培養(yǎng)材料。腦微血管內(nèi)皮細胞原代培養(yǎng)的關(guān)鍵是首先分離獲得純度較高且活力好的腦微血管段,。在解剖過程中仔細去除軟腦膜,、大血管及大腦白質(zhì)收集大腦皮質(zhì)，可減少成纖維細胞和平滑肌細胞的生長，對于提高內(nèi)皮細胞的純度具有重要意義,。由于膠原酶對內(nèi)皮細胞的損傷較小，我們采用0.1%Ⅱ型膠原酶消化剪碎后的大腦皮質(zhì)分散組織,，同組織勻漿法[3,10]相比,，酶消化法可避免組織勻漿對內(nèi)皮細胞的損傷，從而有利于提高細胞的活力,。經(jīng)膠原酶消化后采用20% BSA或15%葡聚糖離心可分離腦微血管段與神經(jīng)組織及大血管，得到底層的腦微血管段,，這種方法被廣泛應用于腦微血管段的分離[5~9,11,12],，我們發(fā)現(xiàn)20% BSA較15%葡聚糖而言，其分離獲得的腦微血管段數(shù)量更多,，而且腦微血管段狀態(tài)更好更易貼壁生長,。由于周細胞是腦微血管內(nèi)皮細胞原代培養(yǎng)中zui常見的雜細胞，它會明顯抑制內(nèi)皮細胞的生長[7],，因此原代培養(yǎng)中應盡量減少周細胞的數(shù)量,，我們采用兩次酶消化方法[7]，控制兩次酶消化的時間,，用0.1%膠原酶/消化酶分散出內(nèi)皮細胞外圍的周細胞,，zui后采用一定濃度的連續(xù)梯度的Percoll分離以去除周細胞和紅細胞得到較純的腦微血管段,。在酶消化過程中加入適量的DNA酶可分散消化過程中釋放的DNA所引起的微血管段凝結(jié)塊，有利于增加微血管段的得率,。對于Percoll離心,，我們嘗試了3個濃度(33%、45%及50%)后發(fā)現(xiàn),，濃度越大,，腦微血管段離靠近離心管底的紅細胞及周細胞越遠，分離效果也越好,，因此采用50% Percoll效果,，并且采用水平轉(zhuǎn)頭的低溫離心機以提高離心效果。內(nèi)皮細胞純化的其他方法有機械刮除法,、克隆培養(yǎng)法,、FACS分類法[13]、Thy1.1免疫反應殺傷法[7,14],、采用血漿來源的胎牛血清[8],、磁珠結(jié)合法[10]等，但是我們發(fā)現(xiàn)機械刮除法和克隆培養(yǎng)法并不適合大鼠腦微血管內(nèi)皮細胞的純化，因為原代內(nèi)皮細胞傳代后狀態(tài)不佳且易被雜細胞所抑制[7],，而后面幾種方法比較昂貴不予推薦,；血漿來源的胎牛血清不含PDGF，不促進雜細胞的生長,，但是其較昂貴，可選擇胎牛血清用于原代培養(yǎng),。
腦微血管內(nèi)皮細胞的原代培養(yǎng)需要涂布明膠,、鼠尾膠、纖連蛋白等基質(zhì)以利于腦微血管段貼壁和內(nèi)皮細胞的生長,。我們嘗試不同基質(zhì)后發(fā)現(xiàn)其對腦微血管段的貼壁和內(nèi)皮細胞的生長作用不同,，纖連蛋白/IV型膠原優(yōu)于鼠尾膠，而鼠尾膠比明膠好,，而且接種密度的要求前者比后兩者要低,，后兩者需要達到一定密度才有利于腦微血管段貼壁。另外我們發(fā)現(xiàn)內(nèi)皮細胞不易生長于玻片上,，而較易生長于塑料培養(yǎng)皿上,，這與文獻報道基本相符[8,14]。內(nèi)皮細胞生長需要添加內(nèi)皮細胞生長因子以促進內(nèi)皮細胞的增殖抑制雜細胞的生長,，我們采用bFGF可有效促進內(nèi)皮細胞的生長,，同時添加100 μg/ml肝素協(xié)同bFGF的作用并可抑制平滑肌細胞的生長[9]。同時為了保證內(nèi)皮細胞的營養(yǎng),，并去除腦微血管段的殘余碎片,，我們采用20% FBS的血清濃度并隔天換液。 我們培養(yǎng)的腦微血管內(nèi)皮細胞呈短梭形,，區(qū)域性單層生長,，隨著培養(yǎng)時間的延長及內(nèi)皮細胞的增殖，可見"漩渦狀"分布,，約5~7天后,，各區(qū)域之間可逐漸融合，其形態(tài)和生長特點與大多數(shù)文獻報道相似[6~9,11,12],。根據(jù)內(nèi)皮細胞的短梭形的形態(tài)特點,、Ⅷ因子相關(guān)抗原表達陽性可鑒定我們所培養(yǎng)的細胞確為腦微血管內(nèi)皮細胞[3,5,8]。 我們的大鼠腦微血管內(nèi)皮細胞體外培養(yǎng)模型的建立,，對于研究腦內(nèi)皮的生理,、生化及藥理研究是一個較好的工具，同時可與星型膠質(zhì)細胞共培養(yǎng)用于構(gòu)建血腦屏障模型[1],。相信隨著技術(shù)方法的不斷改進,，腦微血管內(nèi)皮細胞體外培養(yǎng)的模型將逐漸接近于其在體特征,，并被廣泛應用于相關(guān)研究[1]。
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