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細胞技術專題:大鼠乳鼠成骨細胞培養(yǎng)實驗

2014-2-20  閱讀(1142)

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標簽: 大鼠 乳鼠 成骨細胞

大鼠乳鼠成骨細胞培養(yǎng)培養(yǎng)可以:(1)獲得大鼠乳鼠成骨細胞,;(2)用于骨修復的細胞學機制研究,。

實驗方法

  • 酶消化法
實驗方法原理取材于出生2~3 d 小鼠顱骨,,以含20%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)液進行培養(yǎng),,采用膠原酶消化法分離成骨細胞,,并進行細胞接種與傳代,。采用膠原酶消化法分離培養(yǎng)成骨細胞是一種可靠,、簡便、快速的細胞原代分離培養(yǎng)方法,。
實驗材料

SD大鼠

試劑,、試劑盒

F12 *培養(yǎng)液 胰蛋白酶 Ⅱ型膠原酶 酒精

儀器、耗材

手術器械 磁力攪拌器

實驗步驟一,、實驗步驟


1.  拉頸處死24 小時內(nèi)新生的SD大鼠,,75%乙醇浸泡5 min,取出頭蓋骨,,分離頂骨和額骨,,冰生理鹽水液反復洗滌大鼠乳鼠顱蓋骨標本除去脂肪組織及殘留血,放入另一盛有F12 *培基液的培養(yǎng)皿中再洗滌,, 將顱骨剪成2~5 mm碎片,,將洗滌過的骨碎片用 0.25%胰蛋白酶2 ml 預消化15 min,以清除纖維組織細胞,,棄去上清液(其中主要含成纖維細胞),。


2.  然后以0.1%  Ⅱ型膠原酶10 ml,在37℃環(huán)境中消化 20 分鐘,,室溫下磁力攪拌消化20 分鐘,。靜置數(shù)分鐘,收集消化液,,室溫下以1200 rpm離心10 分鐘,。去除上清液,,用20% 胎牛血清的F12 培養(yǎng)液4 ml 懸 浮細胞,接種于75 ml 培養(yǎng)瓶中,,補培養(yǎng)液8 ml 使每瓶液體量達到12 ml,;對靜置后沉淀部分可再重復以膠原酶消化20 分鐘、磁力攪拌消化15 分鐘,、離心10 分鐘,,將獲得的3 瓶細胞放置于二氧化碳培養(yǎng)箱,在5% CO2,,95%空氣,,37℃溫度下培養(yǎng),24 小時后可見細胞貼壁生長,,胞質(zhì)開始伸展,,換新鮮培養(yǎng)液,以后每隔48 小時換培養(yǎng)液(注:消化視具體情況而定,,也可多消化 1 遍),。


3.  原代培養(yǎng)一般接種后第7 天能長滿。傳代時,,取生長良好,、貼壁松緊適度的成骨細胞 1 瓶,棄去培養(yǎng) 液,,傳代時先以 PBS 沖洗 2 遍,,加 0.25%胰酶1 ml,,室溫下消化3~5 分鐘,,將胰蛋白酶液棄去,加 F12 培養(yǎng)液充分吹打8-10 分鐘,。將已消化的細胞收集,、合并,計數(shù),;用 F12 *培基調(diào)節(jié)至細胞濃度為合適濃 度,。一般取2-5 代成骨細胞進行實驗。代數(shù)太多,,細胞老化或者分化明顯,。
 

二、結(jié)果

如圖所示,,成骨細胞的形狀和成纖維細胞非常相似,,但是不同的是,比成纖維細胞更不容易消化,,尤 其是傳代次數(shù)多,,細胞老化的時候,,非常難消化,并且不易消化成單個細胞,。
 

圖1:成骨細胞

圖2:成骨細胞100倍
 

 
圖3:成骨細胞形成的礦化結(jié)節(jié)

三,、鑒定的方法

1.  堿性磷酸酶(ALP)活性檢測

2.  骨玻璃樣蛋白(BGP)檢測

3.  礦化結(jié)節(jié)檢測

收起 
其他一、討論
 

成骨細胞包繞在硬組織中,,致使處理困難,,可采用骨組織塊法、酶消化法,、骨膜組織塊法,、 骨髓培養(yǎng)法以及薄層骨片經(jīng) EDTA 處理并經(jīng)膠原酶消化,均可培養(yǎng)出成骨細胞,。體外培養(yǎng)的成骨細胞保持 有骨組織細胞的某些特征,。據(jù)文獻報道,不同方法培養(yǎng)的成骨細胞形態(tài)是不同的[1],。

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