聯(lián)系電話
上海北諾生物科技有限公司
中級會員·14年
- 聯(lián)系人：
- 周經理 劉經理
- 電話：
- 021-57730393
- 手機：
- 15800960770
- 傳真：
- 86-021-61496710
- 地址：
- 上海市徐匯區(qū)宜山路520號中華門大廈18樓D座
- 個性化：
- www.bnbiotech.com
掃一掃訪問手機商鋪
一 ,、 原理
Matrigel 是從小鼠EHS肉瘤中提取的基質成分,，含有LN,、IV型膠原、接觸蛋白和肝素硫酸多糖,，鋪在無聚乙烯吡硌烷酮的聚碳酸酯濾膜上,，能在DMEM培養(yǎng)基中重建形成膜結構，這種膜結構與天然基質膜結構極為相似,。
濾膜孔徑一般為8um,，而且膜孔都被Matrigel覆蓋，細胞不能自由穿過,，必須分泌水解酶,，并通過變形運動才能穿過這種鋪有Martrigel的濾膜,，這與體內情況較為相似。
鋪有Martrigel的濾膜放在以Blind Well腔或MICS腔上下室之間,，鋪有Martrigel面朝向上室,，在下室中加有趨化劑，如一定濃度的LN,、FN或小鼠3T3條件培養(yǎng)液或人睪丸上皮成纖維細胞培養(yǎng)液,，上室加入重懸的瘤細胞，具有侵襲能力的細胞在趨化劑誘導下開始穿膜運動,。細胞穿膜所用的時間與Martrigel的用量有關,，選擇25ugMartrigell鋪膜，16小時后觀察結果較為合適,。穿過濾膜的細胞多數(shù)粘附在濾膜下表面,，可用棉簽將上表面的細胞拭去，然后用乙醇固定濾膜,，PE染色,，在光鏡下觀察統(tǒng)計穿過Martrigel的細胞數(shù)。另外用Transwell小室也可進行重建基質膜侵襲分析,，這一方法是在Transwell小室吊籃式上腔的濾膜上鋪上30ugMartrigel,，加入細胞72h后觀察結果。值得注意的是,，細胞在TransWll腔中培養(yǎng)72小時后,，有相當數(shù)量穿過濾膜的細胞不再粘附在濾膜下表面，而是脫落進人下腔溶液中．因此統(tǒng)計穿過基質膜的細胞數(shù)目時應把這部分細胞考慮在內,。腫瘤細胞穿過重建基質膜的能力與它的體內侵襲轉移能力表現(xiàn)出較好的相關性，可以用重建基質膜模型初篩抗侵襲藥物,。
在上述分析中,，如果不在膜上鋪Martrigel而直接將8um孔徑濾膜安放在侵襲腔室上下腔室之間，細胞通過變形運動穿過濾膜,，用這種模型對分析細胞運動能力和藥物對細胞運動能力的影響,。另外，在下室中加有LN或FN或在濾膜下表面鋪上LN或FN,，可分析藥物對腫瘤細胞的趨化性或趨固性的影響,。
二 、 材料
1,、Matrigel 基質膠（威格拉斯生物技術（北京）有限公司）,，10mg/ml，5ml,，分裝成0.5ml/只10個EP管中,；用時加入0.5ml的DMEM,；
Matrivgel在冰上維持液態(tài)，室溫時可迅速凝結成膠,。使用前應從-20℃轉移至4℃待其自然溶化（如過放置）,，避免反復凍融。使用時需接觸Matrivgel的試管,、移液吸頭等均應預冷于4℃,；注意無菌操作；
2,、24-transwell (Coster),；
3、結晶紫染料溶液：結晶紫用甲醇配成0.5%的母液,，使用濃度為0.1％,，用PBS按1：4稀釋后即為染色液；
4,、33%醋酸,；
三 、 實驗步驟
1,、溶液配制：
（1）溶DMEM 500ml,；
NE---A液（1μg/μl，1mg/ml）
母液0.1ml（5mg）+ ddH2O up to 5 ml ,；過濾消毒,，-20℃保存。
NE-DMEM（-6M）
NE---A液（1μg/μl,，1mg/ml） 20.5μl
DMEM UP TO 100 ml
過濾消毒,，4℃保存
（2）NE+CGRP-DMEM（-6M，100ng）
NE---A液（1μg/μl,，1mg/ml） 20.5μl
CGRP-儲存液 50 μl
DMEM UP TO 100 ml
過濾消毒,，4℃保存
（3）NE+IFN-DMEM（-6M,，50ng）
NE---A液（1μg/μl,，1mg/ml） 20.5μl
IFN-γ（25ng/μl） 25 μl
DMEM UP TO 100 ml
過濾消毒，4℃保存
（4）低血清DMEM培養(yǎng)基（上室）
（5）20%FBS-DMEM培養(yǎng)基（下室）
2 ,、 準備
（1）溶膠,，4℃過（Thaw Matrigel at 4℃ overnight.）
（2）室溫下基質膠易成凝膠,，所以,，步驟2和3種使用試管和槍頭要在試驗前-20C預冷,。（Matrigel tends to form gel very quickly at room temerature, therefore, pipets and tips using in steps 2 and 3 have to be chilled at prior to experiements.）
3 、 包被基底膜（冰上操作）
（1）用無血清的冷細胞培養(yǎng)基DMEM稀釋Matrigel膠（10mg/ml to 5 mg/ml)） （Dilute Matrigel (10mg/ml to 5 mg/ml) in serum free-cold cell culture media (RPMI1640, EMEM, DMEM, etc).）
（2）取100ul稀釋膠加到24-well transwell上室中 （Put 100 ul of the diluted matrigel into upper chamber of 24-well transwell）
（3）37℃孵育transwell至少4-5h （Incubate the transwell at 37C at least 4 to 5 h for gelling.）
4 ,、 水化基底膜
用無血清培養(yǎng)基輕洗凝膠 （Gently wash gelled matrigel with warmed serum free-culture media.）
5 ,、 準備細胞懸液和小室
（1）消化法從細胞培養(yǎng)瓶中獲取細胞； （Harvest cells from tissue culture flasks by Trypsin/EDTA,；）
（2）用培養(yǎng)基洗3遍（Wash the cells 3 times with culture media (RPMI1640, EMEM, DMEM etc) containing 1 % FBS.）
（3）重懸細胞,，5×105 cells/ml，1% FBS （Resuspend the cells in media containing 1% FBS at a density of 5×105 cells/ml.）
（4）上室加200 ul細胞懸液 （Put 200 ul of the cell suspension onto the matrigel.）
（5）下室中加入600 ul細胞培養(yǎng)基,，含有5 ug/ml fibronectin作為黏連亞族 （lower chamber of the transwell is filled with 600 ul of culture media containing, as an adhesive subtrate.）
6 ,、 孵育，37℃,，20 to 24 h （Incubate at 37C for 20 to 24 h.
7 ,、 染色和計數(shù)
（1）棉簽擦去上室上面的非侵襲細胞（Scrape off noninvaded cells on the top of the transwell with a cotton swab）
（2）移去transwells，倒置,，風干（Remove transwells from 24-well plates and stained with Diff-Quick solution.）
（3）24孔板中加入500µl含0.1%結晶紫,，將小室置于其中，使膜浸沒在培養(yǎng)基中,，37℃ 30min后取出,，PBS清洗。
（4）直徑上取4個視野,，照相,，計數(shù)。
（5）24孔板中加入500µl 33%醋酸,，將小室置于其中,，浸膜，振蕩10min,，充分溶解,。取出小室，24孔板于酶標儀上570nm測OD值,，間接反應細胞數(shù)。
小技巧：照相前一定要晾干,，照相時將小室正置于載玻片上,，在倒置顯微鏡下觀察、照相,。經濟,、實用、方便,。
