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鑒定蛋白質(zhì)中磷酸化的氨基酸殘基是很有意義的,。磷酸化作用發(fā)生在蛋白質(zhì)的絲氨酸,、蘇氨酸和酩氨酸時,，通過部分的HCl水解及接著進(jìn)行雙向薄層電泳,，可以便利地鑒定 標(biāo)記的磷酸氨基酸。
實(shí)驗方法
- 酸水解法
| 實(shí)驗材料 | 磷酸化蛋白質(zhì) |
|---|---|
| 試劑,、試劑盒 | 印度墨汁 HCl 磷酸氨基酸混合物 電泳緩沖液 茚三酮 |
| 儀器,、耗材 | PVDF膜 烘箱 離心機(jī) 離心管 纖維素薄層色譜 濾紙 薄層電泳儀 |
| 實(shí)驗步驟 | 1. 放射性標(biāo)記的磷酸化蛋白質(zhì)在SDS-聚丙烯酰胺凝膠上進(jìn)行制備電泳。電轉(zhuǎn)移至PVDF膜上,，用水洗膜數(shù)次,，不要讓膜變干,。 2. 用30~50 ml 印度墨汁染色液染膜5~10 min，輕搖至條帶出現(xiàn),。也可在作好放射性或磷光位置標(biāo)記后,，用塑料膜包住膜，進(jìn)行放射性自顯影,。 3. 用干凈刀片切下含目的條帶的膜,，用甲醇將膜重新潤濕1 min，再用多于0.5 ml 水的潤濕,。置于帶螺口蓋的微量離心管,。 4. 加入足夠量的6 mol/l HCl，淹沒膜,，擰緊管蓋,，在110℃烤箱溫育60 min。 5. 自然冷卻,，高速離心2 min,，將液相的水解物移至一個新的微離心管中，真空干燥2 h,。 6. 加入6~10 μl 水,，在旋渦混合器上劇烈振蕩以溶解樣品，高速離心5 min,。 7. 取25%~50%的樣品點(diǎn)樣于20 cm×20 cm×100 μm 纖維素薄層色譜板的樣品孔,。分小份點(diǎn)樣，毎次點(diǎn)加0.25~0.5 μl,，在每次點(diǎn)加之間,，用通過塞有棉花的巴斯德吸管所送出的壓縮空氣吹干加樣點(diǎn)。 8. 取1 μl 非放射性的磷酸氨基酸標(biāo)準(zhǔn)混合物（含磷酸絲氨酸,，磷酸蘇氨酸和磷酸酪氨酸）點(diǎn)在每個樣品之上,，如上分次點(diǎn)加，每次0.25~0.5 μl,。 9. 在大的玻璃托盤或塑料盒內(nèi),，用pH1.9電泳緩沖液浸濕大的吸水紙（帶4個孔），緩緩倒干多余的緩沖液,。將此大吸水紙轉(zhuǎn)移覆蓋在已加樣的薄層色譜板上,，使得色譜板上的4個加樣點(diǎn)位干大吸水紙的四個洞的中央，輕壓吸水紙以潤濕纖錐素和樣品,，當(dāng)色譜板均勻潤濕后,，移去吸水紙。 10. 將薄層色譜板置于電泳裝置內(nèi),，在板的左右兩倆0.5 cm 邊緣用Whatman 3MM 紙搭接,，如果有氣泡,，將其弄平排出。蓋上蓋子,，開始電泳,。在HTLE 7 000電泳儀用雙層厚的Whatman 3MM 紙搭接時，載4個樣品的薄層板在1.5 KV 電泳20 min,。  圖1 磷酸氨基酸在pH1.9進(jìn)行*向電泳分離 11. 電泳后,，取出薄層板，用電吹風(fēng)快速吹干20 min（無須加熱）,。 12. 用pH3.5電泳緩沖液湲濕小的吸水紙,，并如步驟10所述以之去均勻潤濕薄層色譜板,，注意避免將吸水紙放在樣品之上,。 13. 取去小吸水紙，色譜板逆時計轉(zhuǎn)90,。進(jìn)行第二向的電泳,。如使用HTLE 7 000電泳儀，用pH3.5的電極緩沖液,，在1.3 KV 電壓下電泳16 min,。 14. 電泳后取出簿層板，在50~80℃烤箱內(nèi)干烤20~30 min 至*干燥,，噴0.25%茚三酮丙酮溶液,，再加熱5~10 min 使磷酸氨基酸標(biāo)準(zhǔn)品顯跡。 15. 在薄層色譜板上加放射性或發(fā)磷光的定位標(biāo)記后,，使用增感屏在-70℃自顯影,，時間從夜到約10天不等。 16. 自顯影完畢,，在透明的投影膠片上描上定位標(biāo)記和染色顯跡的標(biāo)準(zhǔn)磷酸氨基酸的位 置,，保留色譜板。即可通過對比投影片和感光片來鑒定出放射活性的磷酸氨基酸,。  圖2 磷酸氨基酸在pH3.5進(jìn)行第二向電泳分離  |
