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inverse-PCR是克隆插入片段側(cè)翼序列非常有效的方法,。通常采用的Tail-PCR假陽性太多,，而Inverse-PCR一般只要有特異條帶，基本上就是目的片段,。
基本步驟如下：
1、反向PCR（Inverse PCR）原理：反向PCR是克隆T-DNA插入位點側(cè)翼DNA序列非常有效的方法,。
a. 選擇合適的限制性內(nèi)切酶位點,。并在T-DNA的邊界（左邊界、右邊界均可）和酶切位點附近設(shè)計引物P1,、P2；
b. 回收DNA,，T4連接酶連接,，使酶切后的DNA段環(huán)化；
c. 回收連接后的DNA,，用引物P1、P2做PCR,，就可擴增到兩端為T-DNA插入序列,，中間為側(cè)翼序列的片段。
2,、限制性內(nèi)切酶消化：選擇合適的限制性內(nèi)切酶,，基因組一定要切成彌散性的條帶,。在酶切之前，應(yīng)對基因組DNA定量,。
根據(jù)T-DNA的左邊界序列選擇合適的酶切位點EcoRI,，BamHI和HindIII/PstI，并在酶切位點上游附近設(shè)計引物Z1,，Z2，Z3和Z4,，然后用這些內(nèi)切酶分別消化基因組DNA,，酶切體系如下：
| Buffer for EcoR I | 2μl |
| Genomic DNA | 3μl |
| EcoR I | 0.5μl （10u/μl） |
| ddH2O | 14.5 μl |
| 20μl |
37度 ，電泳檢測酶切效果,。
3、回收DNA
① 將酶切產(chǎn)物轉(zhuǎn)到1.5ml離心管中,，用ddH2O洗滌干凈,，并稀釋到250μl,；
② 加入等體積的酚和氯仿（V：V=1：1），渦旋混勻,，室溫靜置1min；
③ zui大速度（13, 000 rpm）離心1min,；
④ 將上清移到另一管中，加入等體積的氯仿,，渦旋混勻,，室溫靜置1min,；
⑤ zui大速度（13, 000 rpm）離心2min,；
⑥ 將上清移到另一管中,，加入2.5倍體積的-20℃預(yù)冷的無水乙醇，0.1倍體積的3M 乙酸鈉（pH=5.2）,，輕輕振蕩混勻,，室溫靜置5min；
⑦ 4℃zui大速度（13, 000 rpm）離心10~15min,；
⑧ 棄上清，盡量除去管壁上的液體,；
⑨ 加入1ml -20℃預(yù)冷的70%乙醇,，輕輕顛倒幾次。zui大速度（13, 000 rpm）離心5min,；
⑩ 除去乙醇，在超凈臺上平放,，將管壁上的乙醇揮發(fā)掉,，20~40μl ddH2O溶解。-20℃保存,。
4,、連接,。體系如下：
| DNA | 2μl |
| 10×buffer | 10μl |
| T4 ligase | 1μl |
| ddH2O | 87μl |
| 100μl |
12-14℃ overnight
連接體系比較大，而DNA含量比較低,，不需加入PEG4000,，這樣可以促進分子內(nèi)的連接,，減少分子間的連接,。試驗中我們采取蹇文嬰等（2002）的方法（12-14℃連接48h）。連接完成后,，65℃ 水浴10min滅活,。按上述3.抽提回收，溶解于40μl ddH2O中,。
然后就可以用回收的鏈接片段做PCR了,。
