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PCR產(chǎn)物克隆大致分為兩類,，即平頭連接和粘頭連接,。
平頭連接是將制備好的平頭載體和補(bǔ)平或削平的PCR 產(chǎn)物直接進(jìn)行連接。載體可用EcoR V或Sma I切成平頭,；PCR 產(chǎn)物純化后,，可以在22℃用DNA聚合酶I作用30min（利用該酶所具有的3’→5’外切酶活性和5’→3’的聚合酶活性）。如果要求不高,，PCR 產(chǎn)物也可不加處理,。如果使用Stratagene公司的pfu DNA聚合酶或New England Biolabs公司的Vent DNA聚合酶,，這兩種酶有5’→3’校對(duì)能力，擴(kuò)增出來的PCR 產(chǎn)物已經(jīng)是平頭,，可以不作平端處理,。平端連接的一個(gè)顯而易見的缺陷是連接效率低下，即使使用很高單位的連接酶,，或在反應(yīng)體系中加入PEG 8000,，也只能很有限地提率。
粘頭連接也可以大致分為兩類,，一類粘頭連接是用某種方法,，在載體和PCR 產(chǎn)物上產(chǎn)生長(zhǎng)的可互補(bǔ)的粘性末端。zui普遍的方法是在引物的5’端加入一段某種限制酶的識(shí)別序列,。如果兩個(gè)引物選用不同的限制性內(nèi)切酶識(shí)別序列,，就可以做到定向連接。另一類利用部分PCR 產(chǎn)物3’端帶有一個(gè)凸出的dAMP的特性,，構(gòu)建3’端帶有凸出的dTMP的載體,。一般采用的方法是先把載體用某種限制性內(nèi)切酶消化成平頭，在70℃或72℃下在只加入一種dNTP,、即dTTP的反應(yīng)體系中用Taq DNA聚合酶處理半小時(shí)（也有人報(bào)道處理1～2小時(shí)能提高克隆 效率,，這樣加T反應(yīng)會(huì)更*）。也可以用末端轉(zhuǎn)移酶來完成加T反應(yīng),。載體自連,、PCR 產(chǎn)物串連可以忽略。如果使用ddTTP,，效果會(huì)更好。這種方法一般稱為加T/A法克隆 ,，比平頭連接效率高50～100倍,。
一、PCR 產(chǎn)物的TA克隆1. TA克隆 構(gòu)建原理：TA克隆 系統(tǒng)由Invitrogen公司（San Diego,，CA）發(fā)展而來的商業(yè)性試劑盒,，它用于PCR 產(chǎn)物的克隆 和測(cè)序。其原理是利用Taq酶能夠在PCR 產(chǎn)物的3’末端加上一個(gè)非模板依賴的A,，而T載體是一種帶有3’T突出端的載體,，在連接酶作用下，可以快速地,、一步到位地把PCR 產(chǎn)物直接插入到質(zhì)粒載體的多克隆 位點(diǎn)（MCS）中,。
2.操作步驟⑴ 連接反應(yīng)一般在滅菌的0.5ml離心管中進(jìn)行。
⑵ 10μl體積反應(yīng)體系如下：
①取T載體1μl （50ng）,，加入等摩爾數(shù)PCR 產(chǎn)物 ,。
②加入含ATP的10×Buffer 1μl,，T4 DNA連接酶合適單位，用ddH2O 補(bǔ)足至10μl ,。
⑶ 稍加離心,，通常為14-16℃水浴連接8-14hr，或4℃過,。
⑷ 轉(zhuǎn)染,，藍(lán)白斑篩選同前。
二,、注意事項(xiàng)
1.要獲得目的基因的TA克隆 ,，PCR 產(chǎn)物的特異性要好。
2.PCR 產(chǎn)物在TA克隆 前要通過純化,。
3.在PCR 產(chǎn)物回收,、純化過程中防止外來DNA污染。
