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1 樣品RNA的抽提
①取凍存已裂解的細胞,，室溫放置5分鐘使其*溶解。
②兩相分離 每1ml的TRIZOL試劑裂解的樣品中加入0.2ml的氯仿,，蓋緊管蓋,。手動劇烈振蕩管體15秒后，15到30℃孵育2到3分鐘,。4℃下12000rpm離心15分鐘,。離心后混合液體將分為下層的紅色酚氯仿相，中間層以及無色水相上層,。RNA全部被分配于水相中,。水相上層的體積大約是勻漿時加入的TRIZOL試劑的60%,。
③RNA沉淀 將水相上層轉移到一干凈無RNA酶的離心管中,。加等體積異丙醇混合以沉淀其中的RNA，混勻后15到30℃孵育10分鐘后,，于4℃下12000rpm 離心10分鐘,。此時離心前不可見的RNA沉淀將在管底部和側壁上形成膠狀沉淀塊,。
④RNA清洗 移去上清液，每1mlTRIZOL試劑裂解的樣品中加入至少1ml的75%乙醇（75%乙醇用DEPCH2O配制）,，清洗RNA沉淀,。混勻后,，4℃下7000rpm離心5分鐘,。
⑤RNA干燥 小心吸去大部分乙醇溶液，使RNA沉淀在室溫空氣中干燥5-10分鐘,。
⑥溶解RNA沉淀 溶解RNA時,，先加入無RNA酶的水40μl用槍反復吹打幾次，使其*溶解,，獲得的RNA溶液保存于-80℃待用,。
2 RNA質量檢測
1）紫外吸收法測定
先用稀釋用的TE溶液將分光光度計調零。然后取少量RNA溶液用TE稀釋（1:100）后,，讀取其在分光光度計260nm和280nm處的吸收值,，測定RNA溶液 濃度和純度。
① 濃度測定
A260下讀值為1表示40 ?g RNA/ml,。樣品RNA濃度（?g/ml）計算公式為：A260 ×稀釋倍數× 40 ?g/ml,。具體計算如下：
RNA溶于40 ?l DEPC水中，取5ul,，1:100稀釋至495?l的TE中,，測得A260 = 0.21
RNA 濃度= 0.21 ×100 ×40 ?g/ml = 840 ?g/ml 或 0.84 ?g/?l
取5ul用來測量以后，剩余樣品RNA為35 ?l,，剩余RNA總量為：
35 ?l × 0.84 ?g/?l = 29.4 ?g
②純度檢測
RNA溶液的A260/A280的比值即為RNA純度,，比值范圍1.8到2.1。
2）變性瓊脂糖凝膠電泳測定
①制膠
1g瓊脂糖溶于72ml水中,，冷卻至60℃,，10 ml的10× MOPS電泳緩沖液和18 ml的37% 甲醛溶液（12.3 M）。
10×MOPS電泳緩沖液
濃度 成分
0.4M MOPS,，pH 7.0
0.1M 乙酸鈉
0.01M EDTA
灌制凝膠板,，預留加樣孔至少可以加入25 ?l溶液。膠凝后取下梳子,，將凝膠板放入電泳槽內,，加足量的1×MOPS電泳緩沖液至覆蓋膠面幾個毫米。
②準備RNA樣品
取3?gRNA,，加3倍體積的甲醛上樣染液,，加EB于甲醛上樣染液中至終濃度為10?g/ml。加熱至70℃孵育15分鐘使樣品變性,。
③電泳
上樣前凝膠須預電泳5min,，隨后將樣品加入上樣孔,。5-6V/cm電壓下2h，電泳至溴酚蘭指示劑進膠至少2-3cm,。
④紫外透射光下觀察并拍照
28S和18S核糖體RNA的帶非常亮而濃（其大小決定于用于抽提RNA的物種類型）,，上面一條帶的密度大約是下面一條帶的2倍。還有可能觀察到一個更小稍微擴散的帶,，它由低分子量的RNA（tRNA和5S核糖體RNA）組成,。在18S和28S核糖體帶之間可以看到一片彌散的EB染色物質，可能是由mRNA和其它異型RNA組成,。RNA制備過程中如果出現(xiàn)DNA污染,，將會在28S核糖體RNA帶的上面出現(xiàn)，即更高分子量的彌散遷移物質或者帶,，RNA的降解表現(xiàn)為核糖體RNA帶的彌散,。用數碼照相機拍下電泳結果。
3 樣品cDNA合成
①反應體系
序號 反應物 劑量
1 逆轉錄buffer 2μl
2 上游引物 0.2μl
3 下游引物 0.2μl
4 dNTP 0.1μl
5 逆轉錄酶MMLV 0.5μl
6 DEPC水 5μl
7 RNA模版 2μl
8 總體積 10μl
輕彈管底將溶液混合,，6000rpm短暫離心,。
②混合液在加入逆轉錄酶MMLV 之前先70℃干浴3分鐘，取出后立即冰水浴至管內外溫度一致,，然后加逆轉錄酶0.5μl,，37℃水浴60分鐘。
③取出后立即95℃干浴3分鐘,，得到逆轉錄終溶液即為cDNA溶液,，保存于-80℃待用。
4 梯度稀釋的標準品及待測樣品的管家基因（β-actin）實時定量PCR
①β-actin陽性模板的標準梯度制備 陽性模板的濃度為1011,，反應前取3μl按10倍稀釋（加水27μl并充分混勻）為1010,，依次稀釋至109、108,、107,、106、105,、104,，以備用。
②反應體系如下：
標準品反應體系
序號 反應物 劑量
1 SYBR Green 1 染料 10μl
2 陽性模板上游引物F 0.5μl
3 陽性模板下游引物R 0.5μl
4 dNTP 0.5μl
5 Taq酶 1μl
6 陽性模板DNA 5μl
7 ddH2O 32.5μl
8 總體積 50μl
輕彈管底將溶液混合,，6000rpm短暫離心,。
管家基因反應體系：
序號 反應物 劑量
1 SYBR Green 1 染料 10μl
2 內參照上游引物F 0.5μl
3 內參照下游引物R 0.5μl
4 dNTP 0.5μl
5 Taq酶 1μl
6 待測樣品cDNA 5μl
7 ddH2O 32.5μl
8 總體積 50μl
輕彈管底將溶液混合，6000rpm短暫離心,。
③制備好的陽性標準品和檢測樣本同時上機,，反應條件為：93℃ 2分鐘，然后93℃ 1分鐘,，55℃ 2分鐘,，共40個循環(huán)。
5 制備用于繪制梯度稀釋標準曲線的DNA模板
①針對每一需要測量的基因,，選擇一確定表達該基因的cDNA模板進行PCR反應,。
反應體系：
序號 反應物 劑量
1 10× PCR緩沖液 2.5 ul
2 MgCl2 溶液 1.5 ul
3 上游引物F 0.5 ul
4 下游引物R 0.5 ul
5 dNTP混合液 3 ul
6 Taq聚合酶 1 ul
7 cDNA 1 ul
8 加水至總體積為 25ul
輕彈管底將溶液混合，6000rpm短暫離心,。
35個PCR循環(huán)（94℃1分鐘,；55℃1分鐘；72℃1分鐘）,； 72?C延伸5分鐘,。
②PCR產物與 DNA Ladder在2％瓊脂糖凝膠電泳，溴化乙錠染色,，檢測PCR產物是否為單一特異性擴增條帶,。
③將PCR產物進行10倍梯度稀釋: 將PCR產物進行10倍梯度稀釋: 設定PCR產物濃度為1×1010，依次稀釋至109,、108,、107、106,、105,、104幾個濃度梯度。
6 待測樣品的待測基因實時定量PCR
①所有cDNA樣品分別配置實時定量 PCR反應體系,。
體系配置如下：
序號 反應物 劑量
1 SYBR Green 1 染料 10 ul
2 上游引物 1ul
3 下游引物 1ul
4 dNTP 1ul
5 Taq聚合酶 2ul
6 待測樣品cDNA 5ul
7 ddH2O 30ul
8 總體積 50 ul
輕彈管底將溶液混合,，6000rpm短暫離心。
②將配制好的PCR反應溶液置于Realtime PCR儀上進行PCR擴增反應,。反應條件為：93℃2分鐘預變性,，然后按93℃ 1分鐘，55℃1分鐘,，72℃1分鐘,，共40做個循環(huán)，zui后72℃7分鐘延伸,。
7 實時定量PCR使用引物列表
引物設計軟件：Primer Premier 5.0,，并遵循以下原則：引物與模板的序列緊密互補；引物與引物之間避免形成穩(wěn)定的二聚體或發(fā)夾結構,；引物不在模板的非目的位點引發(fā)DNA 聚合反應（即錯配）,。
8 電泳
各樣品的目的基因和管家基因分別進行Realtime PCR反應。PCR產物與 DNA Ladder在2％瓊脂糖凝膠電泳,，GoldView?染色,，檢測PCR產物是否為單一特異性擴增條帶。
