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PCR（Polymerase Chain Reaction，聚合酶鏈反應(yīng)）是一種選擇性體外擴(kuò)增DNA或RNA的方法.它包括三個(gè)基本步驟：（1） 變性（Denature）：目的雙鏈DNA段在94℃下解鏈,；（2） 退火（Anneal）:兩種寡核苷酸引物在適當(dāng)溫度（50℃左右）下與模板上的目的序列通過(guò)氫鍵配對(duì)；（3） 延伸（Extension）:在Taq DNA聚合酶合成DNA的zui適溫度下,，以目的DNA為模板進(jìn)行合成,。由這三個(gè)基本步驟組成一輪循環(huán),，理論上每一輪循環(huán)將使目的DNA擴(kuò)增一倍,，這些經(jīng)合成產(chǎn)生的DNA又可作為下一輪循環(huán)的模板,，所以經(jīng)25-35輪循環(huán)就可使DNA擴(kuò)增達(dá)10⁶ 倍。

一,、 PCR反應(yīng)中的主要成份

1,、引物：PCR反應(yīng)產(chǎn)物的特異性由一對(duì)上下游引物所決定,。引物的好壞往往是PCR成敗的關(guān)鍵。引物設(shè)計(jì)和選擇目的DNA序列區(qū)域時(shí)可遵循下列原則：（1） 引物長(zhǎng)度約為16-30bp,， 太短會(huì)降低退火溫度影響引物與模板配對(duì)，從而使非特異性增高,。太長(zhǎng)則比較浪費(fèi),，且難以合成。（2） 引物中G+C含量通常為40%-60%,，可按下式粗略估計(jì)引物的解鏈溫度 Tm＝4（G+C）+2（A+T）,。（3） 四種堿基應(yīng)隨機(jī)分布，在3'端不存在連續(xù)3個(gè)G或C,，因這樣易導(dǎo)致錯(cuò)誤引發(fā),。（4） 引物3'端與目的序列閱讀框架中密碼子*或第二位核苷酸對(duì)應(yīng)， 以減少由于密碼子擺動(dòng)產(chǎn)生的不配對(duì),。（5） 在引物內(nèi),， 尤其在3'端應(yīng)不存在二級(jí)結(jié)構(gòu)。（6） 兩引物之間尤其在3'端不能互補(bǔ),， 以防出現(xiàn)引物二聚體,， 減少產(chǎn)量。兩引物間不存在4個(gè)連續(xù)堿基的同源性或互補(bǔ)性,。 （7） 引物5'端對(duì)擴(kuò)增特異性影響不大,， 可在引物設(shè)計(jì)時(shí)加上限制酶位點(diǎn)、核糖 體結(jié)合位點(diǎn),、起始密碼子,、缺失或插入突變位點(diǎn)以及標(biāo)記生物素、熒光素,、地高辛等,。通常應(yīng)在5'端限制酶位點(diǎn)外再加1-2個(gè)保護(hù)堿基。（8） 引物不與模板結(jié)合位點(diǎn)以外的序列互補(bǔ),。所擴(kuò)增產(chǎn)物本身無(wú)穩(wěn)定的二級(jí)結(jié)構(gòu),， 以免產(chǎn)生非特異性擴(kuò)增，影響產(chǎn)量,。 （9） 簡(jiǎn)并引物應(yīng)選用簡(jiǎn)并程度低的密碼子,， 例如選用只有一種密碼子的Met， 3'端應(yīng)不存在簡(jiǎn)并性,。否則可能由于產(chǎn)量低而看不見(jiàn)擴(kuò)增產(chǎn)物,。

一般PCR反應(yīng)中的引物終濃度為0.2-1.0μmol/L。引物過(guò)多會(huì)產(chǎn)生錯(cuò)誤引導(dǎo)或產(chǎn)生引物二聚體,， 過(guò)低則降低產(chǎn)量,。利用紫外分光光度計(jì),， 可計(jì)算引物濃度， 在1cm光程比色杯中,，260nm下,，引物濃度可按下式計(jì)算：

X mol/L＝ OD260/ A（16000）+C（70000）+G（12000）+T（9600）

X： 引物摩爾濃度，A,、C,、G、T：引物中4種不同堿基個(gè)數(shù),。

2,、4種三磷酸脫氧核苷酸（dNTP）：dNTP應(yīng)用NaOH 將pH調(diào)至7.0，并用分光光度計(jì)測(cè)定其準(zhǔn)確濃度,。dNTP原液可配成5-10mmol/L并分裝,，-20℃貯存。一般反應(yīng)中每種dNTP的終濃度為20-200μmol/L,。理論上4 種 dNTP各20μmol/L,，足以在100μl反應(yīng)中合成2.6μg的DNA。當(dāng)dNTP終濃度大于50mmol/L時(shí)可抑制Taq DNA聚合酶的活性.4種dNTP的濃度應(yīng)該相等,，以減少合成中由于某種dNTP的不足出現(xiàn)的錯(cuò)誤摻入,。

3、 Mg²⁺：Mg²⁺濃度對(duì)Taq DNA聚合酶影響很大,，它可影響酶的活性和真實(shí)性,，影響引物退火和解鏈溫度， 影響產(chǎn)物的特異性以及引物二聚體的形成等,。通常Mg²⁺ 濃度范圍為0.5-2mmol/L.對(duì)于一種新的PCR反應(yīng),，可以用0.1-5mmol/L的遞增濃度的Mg²⁺ 進(jìn)行預(yù)備實(shí)驗(yàn)，選出zui適的Mg2+濃度,。在PCR反應(yīng)混合物中,， 應(yīng)盡量減少有高濃度的帶負(fù)電荷的基團(tuán)， 例如磷酸基團(tuán)或EDTA等可能影響Mg²⁺ 離子濃度的物質(zhì),，以保證zui適Mg²⁺ 濃度,。

4、 模板：PCR反應(yīng)必須以DNA為模板進(jìn)行擴(kuò)增,， 模板DNA可以是單鏈分子,，也可以是雙鏈分子，可以是線(xiàn)狀分子,，也可以是環(huán)狀分子（線(xiàn)狀分子比環(huán)狀分子的擴(kuò)增效果稍好）,。就模板DNA而言，影響PCR的主要因素是模板的數(shù)量和純度.一般反應(yīng)中的模板數(shù)量為10² -10⁵ 個(gè)拷貝,，對(duì)于單拷貝基因,，這需要0.1μg的人基因組DNA,，10ng的酵母DNA，1ng的大腸桿菌DNA.擴(kuò)增多拷貝序列時(shí),，用量更少.靈敏的PCR可從一個(gè)細(xì)胞,，一根頭發(fā)，一個(gè)孢子或一個(gè)精子提取的DNA中分析目的序列,。模板量過(guò)多則可能增加非特異性產(chǎn)物,。DNA中的雜質(zhì)也會(huì)影響PCR的效率。

5,、 Taq DNA聚合酶：一般Taq DNA聚合酶活性半衰期為92.5℃ 130min，95℃ 40min,， 97℃ 5min?，F(xiàn)在人們又發(fā)現(xiàn)許多新的耐熱的DNA聚合酶，這些酶的活性在高溫下活性可維持更長(zhǎng)時(shí)間,。Taq DNA聚合酶的酶活性單位定義為74℃下,，30min，摻入10nmol/L dNTP到核酸中所需的酶量,。Taq DNA聚合酶的一個(gè)致命弱點(diǎn)是它的出錯(cuò)率,，一般PCR中出錯(cuò)率為2×10^-4 核苷酸/每輪循環(huán)，在利用PCR克隆和進(jìn)行序列分析時(shí)尤應(yīng)注意.在100μl PCR反應(yīng)中,，1.5-2單位的Taq DNA聚合酶就足以進(jìn)行30輪循環(huán).所用的酶量可根據(jù)DNA,、引物及其它因素的變化進(jìn)行適當(dāng)?shù)脑鰷p.酶量過(guò)多會(huì)使產(chǎn)物非特異性增加，過(guò)少則使產(chǎn)量降低.反應(yīng)結(jié)束后,，如果需要利用這些產(chǎn)物進(jìn)行下一步實(shí)驗(yàn),，需要預(yù)先滅活Taq DNA聚合酶， 滅活Taq DNA聚合酶的方法有：（1） PCR產(chǎn)物經(jīng)酚:氯仿抽提,，乙醇沉淀,。 （2） 加入10mmol/L的EDTA螯合Mg²⁺ 。 （3） 99-100℃加熱10min.目前已有直接純化PCR產(chǎn)物的Kit可用,。

6,、反應(yīng)緩沖液：反應(yīng)緩沖液一般含10-50mmol/L Tris·Cl （20℃下pH8.3-8.8）， 50mmol/L KCl和適當(dāng)濃度的Mg²⁺ ,。Tris·Cl在20℃時(shí)pH為8.3-8.8,，但在實(shí)際PCR反應(yīng)中，pH為6.8-7.8. 50mmol/L的KCl有利于引物的退火.另外,，反應(yīng)液可加入5mmol/L的二硫蘇糖醇（DDT）或100μg/ml的牛血清白蛋白（BSA）,，它們可穩(wěn)定酶活性，另外加入T4噬菌體的基因32蛋白則對(duì)擴(kuò)增較長(zhǎng)的DNA段有利,。各種Taq DNA聚合酶商品都有自己特定的一些緩沖液,。

二,、PCR反應(yīng)參數(shù)

1、變性：在*輪循環(huán)前,，在94℃下變性5-10min非常重要,，它可使模板DNA*解鏈，然后加入Taq DNA聚合酶（hot start）,，這樣可減少聚合酶在低溫下仍有活性從而延伸非特異性配對(duì)的引物與模板復(fù)合物所造成的錯(cuò)誤,。變性不*，往往使PCR失敗,，因?yàn)槲醋冃?的DNA雙鏈會(huì)很快復(fù)性,，減少DNA產(chǎn)量.一般變性溫度與時(shí)間為94℃ 1min。在變性溫度下,，雙鏈DNA解鏈只需幾秒鐘即可*,，所耗時(shí)間主要是為使反應(yīng)體系*達(dá)到適當(dāng)?shù)臏囟取?duì)于富含GC的序列,，可適當(dāng)提高變性溫度,。但變性溫度過(guò)高或時(shí)間過(guò)長(zhǎng)都會(huì)導(dǎo)致酶活性的損失。

2,、退火：引物退火的溫度和所需時(shí)間的長(zhǎng)短取決于引物的堿基組成,，引物的長(zhǎng)度、引物與模板的配對(duì)程度以及引物的濃度.實(shí)際使用的退火溫度比擴(kuò)增引物的Tm值約低5℃,。一般當(dāng)引物中GC含量高,，長(zhǎng)度長(zhǎng)并與模板*配對(duì)時(shí)， 應(yīng)提高退火溫度,。退火溫度越高,， 所得產(chǎn)物的特異性越高。有些反應(yīng)甚至可將退火與延伸兩步合并,，只用兩種溫度（例如用60℃和94℃）完成整個(gè)擴(kuò)增循環(huán),， 既省時(shí)間又提高了特異性。退火一般僅需數(shù)秒鐘即可完成,，反應(yīng)中所需時(shí)間主要是為使整個(gè)反應(yīng)體系達(dá)到合適的溫度,。通常退火溫度和時(shí)間為37℃-55℃，1-2min,。

3,、延伸：延伸反應(yīng)通常為72℃，接近于Taq DNA聚合酶的zui適反應(yīng)溫度75℃,。實(shí)際上,，引物延伸在退火時(shí)即已開(kāi)始，因?yàn)門(mén)aq DNA聚合酶的作用溫度范圍可從20℃-85℃.延伸反應(yīng)時(shí)間的長(zhǎng)短取決于目的序列的長(zhǎng)度和濃度.在一般反應(yīng)體系中,，Taq DNA聚合酶每分鐘約可合成2kb長(zhǎng)的DNA,。延伸時(shí)間過(guò)長(zhǎng)會(huì)導(dǎo)致產(chǎn)物非特異性增加.但對(duì)很低濃度的目的序列,， 則可適當(dāng)增加延伸反應(yīng)的時(shí)間。一般在擴(kuò)增反應(yīng)完成后,，都需要一步較長(zhǎng)時(shí)間（10-30min）的延伸反應(yīng),，以獲得盡可能完整的產(chǎn)物， 這對(duì)以后進(jìn)行克隆或測(cè)序反應(yīng)尤為重要,。

4,、循環(huán)次數(shù)： 當(dāng)其它參數(shù)確定之后， 循環(huán)次數(shù)主要取決于DNA濃度,。一般而言25-30輪循環(huán)已經(jīng)足夠,。循環(huán)次數(shù)過(guò)多，會(huì)使PCR產(chǎn)物中非特異性產(chǎn)物大量增加,。通常經(jīng)25-30輪循環(huán)擴(kuò)增后,， 反應(yīng)中Taq DNA聚合酶已經(jīng)不足， 如果此時(shí)產(chǎn)物量仍不夠,， 需要進(jìn)一步擴(kuò)增， 可將擴(kuò)增的DNA樣品稀釋10³-10⁵倍作為模板,， 重新加入各種反應(yīng)底物進(jìn)行擴(kuò)增,， 這樣經(jīng)60輪循環(huán)后， 擴(kuò)增水平可達(dá)10⁹-10¹⁰ ,。