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逆轉(zhuǎn)錄-聚合酶鏈反應(yīng) （Reverse Transcription-Polymerase Chain Reaction，RT-PCR）的原理是：提取組織或細胞中的總RNA，以其中的mRNA作為模板,，采用Oligo（dT）或隨機引物利用逆轉(zhuǎn)錄酶反轉(zhuǎn)錄成cDNA,。再以cDNA為模板進行PCR擴增，而獲得目的基因或檢測基因表達,。RT-PCR使RNA檢測的靈敏性提高了幾個數(shù)量級,，使一些極為微量RNA樣品分析成為可能。該技術(shù)主要用于：分析基因的轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物,、獲取目的基因、合成cDNA探針,、構(gòu)建RNA轉(zhuǎn)錄系統(tǒng)。

一,、反轉(zhuǎn)錄酶的選擇

1． Money 鼠白血病病毒（MMLV）反轉(zhuǎn)錄酶：有強的聚合酶活性，RNA酶H活性相對較弱,。zui適作用溫度為37℃。

2．禽成髓細胞瘤病毒（AMV）反轉(zhuǎn)錄酶：有強的聚合酶活性和RNA酶H活性,。zui適作用溫度為42℃。

3．Thermus thermophilus,、Thermus flavus等嗜熱微生物的熱穩(wěn)定性反轉(zhuǎn)錄酶：在Mn²⁺存在下，允許高溫反轉(zhuǎn)錄RNA,，以消除RNA模板的二級結(jié)構(gòu),。

4．MMLV反轉(zhuǎn)錄酶的RNase H-突變體：商品名為Superscript 和SuperScriptⅡ,。此種酶較其它酶能多將更大部分的RNA轉(zhuǎn)換成cDNA,，這一特性允許從含二級結(jié)構(gòu)的、低溫反轉(zhuǎn)錄很困難的mRNA模板合成較長cDNA,。

二,、合成cDNA引物的選擇

1．   隨機六聚體引物：當特定mRNA由于含有使反轉(zhuǎn)錄酶終止的序列而難于拷貝其全長序列時，可采用隨機六聚體引物這一不特異的引物來拷貝全長mRNA,。用此種方法時,，體系中所有RNA分子全部充當了cDNA*鏈模板，PCR引物在擴增過程中賦予所需要的特異性,。通常用此引物合成的cDNA中96%來源于rRNA,。

2．   Oligo（dT）：是一種對mRNA特異的方法。因絕大多數(shù)真核細胞mRNA具有3’端Poly（A+）尾,，此引物與其配對,，僅mRNA可被轉(zhuǎn)錄。由于Poly（A+）RNA僅占總RNA的1-4%,，故此種引物合成的cDNA比隨機六聚體作為引物和得到的cDNA在數(shù)量和復雜性方面均要小,。

3．   特異性引物：zui特異的引發(fā)方法是用含目標RNA的互補序列的寡核苷酸作為引物，若PCR反應(yīng)用二種特異性引物,，*條鏈的合成可由與mRNA 3’端zui靠近的配對引物起始,。用此類引物僅產(chǎn)生所需要的cDNA，導致更為特異的PCR擴增,。

三,、 試劑準備

1．RMA提取試劑

2．*鏈cDNA合成試劑盒

3．dNTPmix：含dATP、dCTP,、dGTP,、dTTP各2mM

4．Taq DNA聚合酶

四、操作步驟

1. 總RNA的提?。阂娤嚓P(guān)內(nèi)容,。

2. cDNA*鏈的合成：目前試劑公司有多種cDNA*鏈試劑盒出售，其原理基本相同,，但操作步驟不一?，F(xiàn)以GIBICOL公司提供的SuperScriptTM Preamplification System  for First Strand cDNA Synthesis 試劑盒為例。

① 在0.5ml微量離心管中,，加入總RNA 1-5μg,，補充適量的DEPC H2O使總體積達11μl。在管中加10μM Oligo（dT）12-18 1μl,，輕輕混勻,、離心。

② 70℃加熱10min,，立即將微量離心管插入冰浴中至少1min,。

然后加入下列試劑的混合物：10×PCR buffer  2μl；25mM MgCl₂  2μl,；10mM dNTPmix 1μl,；0.1M DTT  2μl

輕輕混勻，離心,。42℃孵育2-5min,。

③ 加入SuperscriptⅡ1μl ，在42℃水浴中孵育50min,。

④ 于70℃加熱15min以終止反應(yīng),。

⑤ 將管插入冰中，加入RNase H 1μl ，37℃孵育20min,，降解殘留的RNA,。-20℃保存?zhèn)溆谩?/p>

3．PCR：

① 取0.5ml PCR管，依次加入下列試劑：*鏈cDNA   2μl,；上游引物（10pM） 2μl,；下游引物（10pM） 2μl；dNTP（2mM） 4μl,；10×PCR buffer 5μl,；Taq 酶（2u/μl） 1μl。

② 加入適量的ddH₂O,，使總體積達50μl,。輕輕混勻，離心,。

③ 設(shè)定PCR程序,。在適當?shù)臏囟葏?shù)下擴增28-32個循環(huán),。為了保證實驗結(jié)果的可靠與準確,，可在PCR擴增目的基因時，加入一對內(nèi)參（如G3PD）的特異性引物,，同時擴增內(nèi)參DNA,，作為對照。

④ 電泳鑒定：行瓊脂糖凝膠電泳,，紫外燈下觀察結(jié)果,。

⑤ 密度掃描、結(jié)果分析：采用凝膠圖像分析系統(tǒng),，對電泳條帶進行密度掃描,。

五、注意事項

1．在實驗過程中要防止RNA的降解,，保持RNA的完整性,。在總RNA的提取過程中，注意避免mRNA的斷裂,。

2． 為了防止非特異性擴增,，必須設(shè)陰性對照。

3．內(nèi)參的設(shè)定：主要為了用于靶RNA的定量,。常用的內(nèi)參有G3PD（甘油醛-3-磷酸脫氫酶）,、β-Actin（β-肌動蛋白）等。其目的在于避免RNA定量誤差,、加樣誤差以及各PCR反應(yīng)體系中擴增效率不均一各孔間的溫度差等所造成的誤差,。

4． PCR不能進入平臺期，出現(xiàn)平臺效應(yīng)與所擴增的目的基因的長度、序列,、二級結(jié)構(gòu)以及目標DNA起始的數(shù)量有關(guān),。故對于每一個目標序列出現(xiàn)平臺效應(yīng)的循環(huán)數(shù)，均應(yīng)通過單獨實驗來確定,。

5． 防止DNA的污染：① 采用DNA酶處理RNA樣品,；② 在可能的情況下，將PCR引物置于基因的不同外顯子,，以消除基因和mRNA的共線性,。