聯(lián)系電話
上海北諾生物科技有限公司
中級(jí)會(huì)員·14年
- 聯(lián)系人：
- 周經(jīng)理 劉經(jīng)理
- 電話：
- 021-57730393
- 手機(jī)：
- 15800960770
- 傳真：
- 86-021-61496710
- 地址：
- 上海市徐匯區(qū)宜山路520號(hào)中華門(mén)大廈18樓D座
- 個(gè)性化：
- www.bnbiotech.com
- 網(wǎng)址：
- www.bnbiotech.com
掃一掃訪問(wèn)手機(jī)商鋪
原位PCR是原位雜交細(xì)胞定位和PCR的高靈敏度相結(jié)合的技術(shù),，使得靶基因檢測(cè)有了極大的改進(jìn),。此技術(shù)是在細(xì)胞（爬片,、甩片或涂片）或組織（石蠟,、冰凍切片）上直接對(duì)靶基因片段進(jìn)行擴(kuò)增,，通過(guò)摻入標(biāo)記基團(tuán)直接顯色或結(jié)合原位雜交進(jìn)行檢測(cè)的方法,。
一、組織切片和細(xì)胞樣品的制備
試劑與配置
10%福爾馬林,；二甲苯,；PBS
操作方法
1. 用10%福爾馬林固定組織8~15hr，石蠟包埋,，切片（4μm）,，將切片置于新鮮的二甲苯中處理5min，放入無(wú)水乙醇中浸泡5min,，取出,，空氣干燥；
2. 對(duì)于培養(yǎng)細(xì)胞,，可直接制備爬片,，也可有PBS洗細(xì)胞一次，加10%福爾馬林靜置,，用橡膠刮下細(xì)胞,；用PBS洗細(xì)胞兩次,，2000rpm×3min，用5ml PBS重懸細(xì)胞,，即可用甩片機(jī)甩片或直接吸50μl點(diǎn)在載玻片上,。
二、切片預(yù)處理（蛋白酶消化）
試劑與配置
0.1mol/L Tris-HCl （pH7.4）
緩沖液A：0.1mol/L Tris-HCl （pH7.4）,，0.3% Tween-20，0.5% NP-40
蛋白酶K：20-50μg/ml,，溶于TE中
操作方法
1. 干燥后的切片置于0.1mol/L Tris-HCl （pH7.4）中,，室溫孵育5min；
2. 浸入緩沖液A中,，室溫孵育10min,；
3. 滴加20μl蛋白酶K液于標(biāo)本上，在濕盒中37℃孵育20min,；
4. 在室溫下,，用0.1mol/L Tris-HCl （pH7.4）漂洗兩次，每次5min,。
三,、原位擴(kuò)增（以標(biāo)記生物素為例）
試劑與配置
PCR反應(yīng)緩沖液：兩種引物各100pmol，dATP,、dCTP,、dGTP和dTTP各200μmol， Bio-dUTP 50mol,，1×PCR緩沖液,；
Tag酶：5U/μl
緩沖液B：0.01mol/L PBS，0.1% Triton-X100
指甲油（市售）
無(wú)水乙醇
操作方法
1. 切片用1×PCR緩沖液平衡3次,，每次5min,；
2. 用濾紙吸去切片上多余的液體，置60℃,，每片加入30μl PCR反應(yīng)緩沖液,，5U Tag酶，用蓋玻片封片,，四周封以指甲油,，防止蒸發(fā)；
3. 94℃變性5min,，按下列條件（94℃×2min,，55℃×2min，72℃×3min）循環(huán)20~25次后,，72℃延伸5min,；
4. 玻片浸入無(wú)水乙醇中10min,，以軟化指甲油；
5. 用刀片撬開(kāi)蓋玻片并除去,；
6. 用緩沖液B漂洗兩次,，每次3min；
7. 用無(wú)水乙醇固定5min,，并吹干,。
四、檢測(cè)（以ABC法為例）
試劑與配置
緩沖液C：0.1mol/L Tris-HCl （pH7.5）,，0.1mol/LNaCl,，2mmol/L MgCl2， 0.5% Triton-X100
封閉液：3%BSA（溶于緩沖液C中）
顯色液：0.05%DAB,，溶于0.05mol/L Tris-HCl （pH7.4）,，臨用前每10ml加30%過(guò)氧化氫50μl
1%鹽酸酒精液
蘇木素染色液
操作方法
1. 用30μl 3%BSA滴加在玻片上，封閉1hr,；
2. 用緩沖液C簡(jiǎn)洗1min,，每片滴加ABC復(fù)合物20～30μl，室溫放置40min,；
3. 緩沖液B室溫漂洗3次,，每次15min；
4. 滴加顯色液于玻片上,，鏡下觀察控制顯色時(shí)間（一般7～14min）,；
5. 流水洗片，浸入蘇木素液中復(fù)染30s,，1%鹽酸酒精分化（提抽2次）,；
6. 常規(guī)脫水、透明,、封片,，鏡下觀察。
