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真核生物的一切有核細(xì)胞（包括培養(yǎng)細(xì)胞）都能用來(lái)制備基因組 DNA,。真核生物的DNA是以染色體的形式存在于細(xì)胞核內(nèi)，因此,，制備DNA的原則是既要將DNA與蛋白質(zhì),、脂類(lèi)和糖類(lèi)等分離,，又要保持DNA分子的完整,。
實(shí)驗(yàn)方法
- 小量制備
- 氯化銫法
| 實(shí)驗(yàn)方法原理 | 提取DNA的一般過(guò)程是將分散好的組織細(xì)胞在含SDS（十二烷基硫酸鈉）和蛋白酶K的溶液中消化分解蛋白質(zhì)，再用酚和氯仿/異戊醇抽提分離蛋白質(zhì),，得到的DNA溶液經(jīng)乙醇沉淀使DNA從溶液中析出,。 |
|---|---|
| 實(shí)驗(yàn)材料 | 細(xì)菌 |
| 試劑、試劑盒 | 溴化乙錠 氯化銫 丁醇 |
| 儀器,、耗材 | 離心機(jī) 巴斯吸管 搖床 |
| 實(shí)驗(yàn)步驟 | 1. 培養(yǎng)100 ml 細(xì)菌培養(yǎng)物至飽和狀態(tài),，用JA-20轉(zhuǎn)子4 000 g 離心10 min。 2. 用9.5 ml 的TE緩沖液重懸沉淀,。 3. 加0.5 ml 10%的SDS和50 μl 20 mg/ml 的蛋白酶K,，混合，于37℃溫育1 h,。 4. 加1.8 ml 5 mol/l NaCl,，充分混合，加入1. 5 ml CTAB/NaCl溶液,，混合,，于65℃溫育20 min。 5. 加等體積的氯仿/異戊醇抽提,，室溫下6 000 g 離心10 min,，用寬口吸管將上清液轉(zhuǎn)移至新管中,。 6. 加化6體積的異丙醇，輕輕混合直至沉淀下來(lái),，用一個(gè)封口的巴斯德吸管將沉淀轉(zhuǎn)移至70%乙醇中冼滌,。 7. 10 000 g 離心5 min，棄上清,，用4 ml TE緩沖液重懸沉淀,。 8. 用分光光度計(jì)檢測(cè)DNA的濃度，將其調(diào)節(jié)到50~100 μg/ml,。 9. 每4 ml 緩沖液加人4.3 g CsCl,，并使之溶解，加入200 μl 的10 mg/ml 的溴化乙錠,。 10. 轉(zhuǎn)移至4 ml 快封口離心管中,，調(diào)節(jié)體積，用TE緩祌液配制的CsCl平衡離心管,，封住管口。 11. 用VTi80轉(zhuǎn)子于15℃,，以420 000 g 離心4 h或 250 000 g,。 12. 在長(zhǎng)波紫外燈下觀察梯帶，用15號(hào)針頭和3 ml 塑料注射器移出條帶,。 13. 用CsCl飽和的異丙醇或水飽和的丁醇離心抽提,，以除去溴化乙錠。 14. 在2 L TE緩沖液中透折以除去CsCl,，如果必要,，沉淀DNA并重新溶解至所需要的濃度。 |
