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1 主題內(nèi)容與適用范圍

本文規(guī)定了食品中大腸菌群,、糞大腸菌群和大腸桿菌檢驗方法,。

本文適用于航空食品的檢驗。

2 設(shè)備和材料

吸管（1ml、10ml）,、恒溫培養(yǎng)箱（36±1℃,、44.5±0.5℃）、冰箱,、均質(zhì)器,、振蕩器、平皿,、稀釋瓶,、天平、顯微鏡等

3 培養(yǎng)基和試劑

月桂基硫酸鹽胰蛋白月示（LST）肉湯,、煌綠乳糖膽鹽（BGLB）肉湯,、EC肉湯、伊紅美藍(lán)瓊脂（EMB）,、營養(yǎng)瓊脂斜面,、色氨酸肉湯、MR-PV培養(yǎng)基,、Korser氏枸掾酸鹽肉湯,、結(jié)晶紫中性紅膽鹽瓊脂（VRBA）,、Butterfield氏磷酸鹽緩沖稀釋液,、生理鹽水、革蘭氏染色液,、Kovacs氏靛基質(zhì)試劑,、甲基紅指示劑、Voges-proskauer（V-P）試劑,、

4 樣品制備

4.1 以無菌操作取有代表性的樣品盛于滅菌容器內(nèi),。如有包裝，則用75%乙醇在包裝開口處擦拭后取樣,。

4.2 制備樣品勻液

以無菌操作取25g樣品,，放入裝有225ml稀釋劑的滅菌均質(zhì)杯內(nèi)，于8000r/min均質(zhì)1-2min,，制成1：10的樣品勻液,。如樣品均質(zhì)時間超過2min，應(yīng)在均質(zhì)杯外加冰水冷卻,。

4.3 稀釋樣品勻液

用10ml滅菌吸管準(zhǔn)確吸取1：10的樣品勻液10ml,，放入裝有90ml稀釋劑的150ml稀釋瓶中。迅速振搖,，將樣品混勻,，制成1：100的樣品勻液。

5 大腸菌群的測定

5.1 大腸菌群MPN值的測定

5.1.1 對每個樣品，選擇適宜的三個連續(xù)稀釋度的樣品稀釋液,。每個稀釋度接種三管月桂基硫酸鹽胰蛋白月示（LST）肉湯,，每管接種1ml。

5.1.2 將接種管置于36±1℃的培養(yǎng)48±2h,。

5.1.3 觀察試管的產(chǎn)氣情況：檢查倒管內(nèi)是否有氣泡產(chǎn)生,，記錄在24h和48h內(nèi)產(chǎn)氣的LST肉湯管數(shù)。如所有LST肉湯管均未產(chǎn)氣,，則可報告為大腸菌群陰性,；如有產(chǎn)氣者，則進(jìn)一步作證實試驗,。

5.2 大腸菌群的證實試驗

5.2.1 將所有產(chǎn)氣管用直徑為3mm的接種環(huán)移種到煌綠乳糖膽鹽（BGLB）肉湯管中,。

5.2.2 置BGLB肉湯管于36±1℃的培養(yǎng)48±2h。

5.2.3 記錄所有BGLB肉湯管的產(chǎn)氣管數(shù),。

5.2.4 結(jié)果報告：按BGLB肉湯產(chǎn)氣管數(shù),，查MPN表報告每克（毫升）樣品中大腸菌群的MPN值。

6 糞大腸菌群測定

6.1 用接種環(huán)將所有48±2h內(nèi)產(chǎn)氣的LST肉湯管培養(yǎng)物移種于EC肉湯管中,。

6.2 將所有接種的EC肉湯管在30min內(nèi)放入44.5±0.5℃水浴箱內(nèi),，培養(yǎng)24±2h。水浴箱的水平面應(yīng)高于肉湯培養(yǎng)基液面,。應(yīng)以已知為44.5℃產(chǎn)氣陽性的大腸桿菌和44.5℃不產(chǎn)氣的產(chǎn)氣腸桿菌或其他大腸菌群細(xì)菌作陽性和陰性對照,。

6.3 記錄EC肉湯管的產(chǎn)氣情況。產(chǎn)氣管為糞大腸菌群試驗陽性,；不產(chǎn)氣管為糞大腸菌群試驗陰性,。

6.4 結(jié)果報告：按產(chǎn)氣管數(shù)，查MPN表報告每克（毫升）樣品中糞大腸菌群的MPN值,。

7 大腸桿菌測定

7.1 將6.3條中的EC肉湯管繼續(xù)培養(yǎng)24h取其產(chǎn)氣管的培養(yǎng)物劃線接種于伊紅美藍(lán)（EMB）平板,，36±1℃的培養(yǎng)24±2h。

7.2 檢查平板上有無具黑色中心有光澤或無光澤的典型菌落,。

7.3 如有典型菌落,，則從每個平板上至少挑取2個典型菌落；如無典型菌落,，則從每個平板上至少挑取2個可疑菌落,。用接種針接觸菌落中心部位，移種到營養(yǎng)瓊脂斜面上,，36±1℃的培養(yǎng)18-24h,。

7.4 將斜面培養(yǎng)物移種到下列培養(yǎng)基進(jìn)行生化試驗。

7.4.1 色氨酸肉湯：在36±1℃的培養(yǎng)24±2h后,，加Kovacs氏試劑0.2-0.3ml,，上層出現(xiàn)紅色為靛基質(zhì)陽性反應(yīng),。

7.4.2 MR-VP培養(yǎng)基：在36±1℃的培養(yǎng)48±2h后。以無菌操作移取培養(yǎng)物1ml至13mm*100mm試管中,，加5%萘酚乙醇溶液0.6ml,，40%氫氧化鉀溶液0.2ml和少許肌酸結(jié)晶，振搖試管后靜置2h,，如出現(xiàn)伊紅色,，為VP試驗陽性。

將 MR-VP培養(yǎng)物的剩余部分再培養(yǎng)48h滴加5滴甲基紅溶液,。如培養(yǎng)物變紅色,，為甲基紅試驗陽性，若變黃色則為陰性反應(yīng),。

7.4.3 Korser氏枸掾酸鹽肉湯：于36±1℃的培養(yǎng)96h記錄有無生長,。

7.4.4 LST肉湯：于36±1℃的培養(yǎng)48±2h，觀察試管中是否產(chǎn)氣,。

7.4.5 革蘭氏染色：取18h營養(yǎng)瓊脂斜面培養(yǎng)物作革蘭氏染色,。大腸桿菌為革蘭氏陰性。

7.4.6 大腸桿菌與非大腸桿菌生化鑒別如下

如出現(xiàn)上表以外的生化反應(yīng)類型,，表明培養(yǎng)物可能不純,，應(yīng)重新劃線分離，必要時做重復(fù)試驗,。

7.5 結(jié)果報告：大腸桿菌為革蘭氏陰性無芽孢桿菌,，發(fā)酵乳糖產(chǎn)酸產(chǎn)氣，IMViC試驗為++--或-+--,，再根據(jù)LST肉湯陽性管數(shù)查MPN表,，報告每克（毫升）樣品中大腸桿菌MPN值,。

注：本文參照SN0169-92《出口食品中大腸菌群,、糞大腸菌群和大腸桿菌檢驗方法》