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嚴(yán)格的消毒滅菌對細(xì)胞與胚胎工程研究與應(yīng)用工作極為重要,，直接影響著整個實(shí)驗(yàn)?zāi)芊耥樌M(jìn)行。

（一）消毒滅菌方法
目前常用的消毒滅菌方法多采用物理方法（如干熱滅菌法,、濕熱滅菌法、過濾除菌法,、射線殺菌法等）和化學(xué)方法（消毒劑,、抗生素）兩大類。

1．干熱滅菌法
是利用恒溫干燥箱內(nèi)120 ºC～150 ºC的高熱,，并保持90～120分鐘,，殺死細(xì)菌和芽孢，達(dá)到滅菌目的的一種方法,。主要適用于不便在壓力蒸汽滅菌器中進(jìn)行滅菌,，且不易被高溫?fù)p壞的玻璃器皿、金屬器械以及不能和蒸汽接觸的物品的滅菌,。用此方法滅菌的物品干燥,，易于貯存。酒精燈火焰燒灼滅菌法也是屬于干熱滅菌的方法之一,，在進(jìn)行動物細(xì)胞體外培養(yǎng)工作時,，常須利用工作臺面上的酒精燈火焰對金屬器具及玻璃器皿口緣進(jìn)行補(bǔ)充滅菌。

2．濕熱滅菌法
壓力蒸汽濕熱滅菌法是目前zui常用的一種滅菌方法,。它利用高壓蒸汽以及在蒸汽環(huán)境中存在的潛熱作用和良好的穿透力,，使菌體蛋白質(zhì)凝固變性而使微生物死亡。適合于布類工作衣,、各種器皿,、金屬器械、膠塞,、蒸餾水,、棉塞、紙和某些培養(yǎng)液的滅菌,。高壓蒸汽滅菌器的蒸汽壓力一般調(diào)整為1.0～1.1 kg/cm²,，維持20～30 min即可達(dá)到滅菌效果。



3．射線滅菌法
利用紫外線燈進(jìn)行照射滅菌的方法,。紫外線是一種低能量的電磁輻射,，可以殺滅多種微生物。紫外線的作用機(jī)制是通過對微生物的核酸及蛋白質(zhì)等的破壞作用而使其滅活,。適合于實(shí)驗(yàn)室空氣,、地面、操作臺面滅菌,。滅菌時間為30 min,。用紫外線殺菌時應(yīng)注意，不能邊照射邊進(jìn)行實(shí)驗(yàn)操作,，因?yàn)樽贤饩€不僅對人體皮膚有傷害,，而且對培養(yǎng)物及一些試劑等也會產(chǎn)生不良影響,。

4．過濾除菌法
是將液體或氣體通過有微孔的濾膜過濾，使大于濾膜孔徑的細(xì)菌等微生物顆粒阻留,，從而達(dá)到除菌的方法,。過濾除菌法大多用于遇熱易發(fā)生分解、變性而失效的試劑,、酶液,、血清、培養(yǎng)液等,。目前,，常用微孔濾膜金屬濾器或塑料濾器正壓過濾除菌，或用玻璃細(xì)菌濾器,、濾球負(fù)壓過濾除菌,。濾膜孔徑應(yīng)在0.22～0.45 μm范圍內(nèi)或用更小的細(xì)菌濾膜，溶液通過濾膜后,，細(xì)菌和孢子等因大于濾膜孔徑而被阻,，并利用濾膜的吸附作用，阻制小于濾膜孔徑的細(xì)菌透過,。

5．化學(xué)消毒劑消毒法
用于那些不能利用物理方法進(jìn)行滅菌的物品、空氣,、工作面,、操作者皮膚、某些實(shí)驗(yàn)器皿等,。常用的化學(xué)消毒劑包括甲醛,、高錳酸鉀、70%～75%乙醇,、過氧乙酸,、來蘇爾水、0.1%新潔爾滅,、環(huán)氧乙烷,、碘伏或碘酊等。其中利用70%～75%乙醇,、0.1%～0.2%,、10%次氯酸鈉、飽和漂等進(jìn)行實(shí)驗(yàn)材料的滅菌,；利用甲醛加高錳酸鉀[（2 mL甲醛+1g高錳酸鉀）/m³]或乙二醇（6mL/m³）等加熱熏蒸法進(jìn)行無菌室和培養(yǎng)室的消毒,。在使用時應(yīng)注意安全，特別是用在皮膚或?qū)嶒?yàn)材料上的消毒劑,，須選用合適的藥劑種類,、濃度和處理時間,，才能達(dá)到安全和滅菌的目的。

6．抗生素抑菌法
主要用于培養(yǎng)液,，是培養(yǎng)過程中預(yù)防微生物污染的重要手段以及作為微生物污染不嚴(yán)重時的“急救”措施,。常用的抗生素有青霉素、鏈霉素和新霉素等,。

（二）不同種類物品及培養(yǎng)物的消毒滅菌方法

1．無菌操作室滅菌
培養(yǎng)材料進(jìn)行培養(yǎng),、觀察或更換培養(yǎng)液時，必須從各方面防止任何污染物進(jìn)入培養(yǎng)液或容器,，所以無菌操作室的滅菌是至關(guān)重要的,。由于無菌操作室的污染來源主要是空氣中的細(xì)菌和真菌孢子，因此長期停用后的無菌操作室應(yīng)進(jìn)行熏蒸滅菌,，熏蒸是用高錳酸鉀+甲醛[（2ml甲醛+1g高錳酸鉀）/m³]進(jìn)行無菌室的滅菌,。經(jīng)常使用的無菌操作室，在每次使用前都應(yīng)進(jìn)行地面衛(wèi)生清潔,，并用紫外線燈照射30 min,，進(jìn)行空氣滅菌。對超凈工作臺,，每次操作前用紫外燈照射30 min,，然后用70%～75%酒精擦拭。

2．培養(yǎng)液滅菌
培養(yǎng)液在制備過程中帶有各種雜菌,，分裝后應(yīng)立即滅菌,，或在24小時內(nèi)完成滅菌工序。目前常用過濾除菌法除去培養(yǎng)物操作液和培養(yǎng)液中的細(xì)菌,?；?qū)ε囵B(yǎng)液中耐熱組分先進(jìn)行高壓蒸汽滅菌，然后在無菌室加入經(jīng)過過濾除菌的不耐熱溶液,，混勻后分裝備用,。
使用高壓蒸汽滅菌器滅菌時，將分裝好的培養(yǎng)液放入底部有一定量（淹沒加熱管）涼水的高壓蒸汽滅菌器內(nèi),，增壓至0.35~0.4 kg/cm²時排凈滅菌器內(nèi)冷空氣,，以便使蒸汽能到達(dá)各個消毒部位，保證消毒滅菌*,。然后繼續(xù)加壓加熱,，當(dāng)壓力表讀數(shù)達(dá)到1.0~1.1 kg/cm²為121 ºC，保持15~20 min即可,。由于消毒滅菌效果取決于溫度而不是壓力,，所以在一定壓力下保持較長的消毒滅菌時間是必須的。在121 ºC的蒸汽溫度下可以很快殺死各種細(xì)菌及高度耐熱的芽孢桿菌，因此許多培養(yǎng)液的消毒滅菌壓力,、溫度一般保持在1.0~1.1 kg/cm²,、121ºC。消毒滅菌時間與需要消毒滅菌的培養(yǎng)液量密切相關(guān)（表2-3）,，時間不足達(dá)不到滅菌效果,，時間過長培養(yǎng)液內(nèi)的一些化學(xué)物質(zhì)遭到破壞，影響培養(yǎng)液成分,。消毒滅菌結(jié)束后,，關(guān)閉熱源，只有當(dāng)滅菌器內(nèi)壓力降為零時才能打開放氣閥,，排除剩余蒸汽,，取出培養(yǎng)液。不可在壓力較高時打開放氣閥,，引起減壓沸騰,，使容器中液體溢出。培養(yǎng)液組成中如含有遇熱易分解的物質(zhì),，則需用過濾方法消毒滅菌,。首先對培養(yǎng)液中耐熱組分進(jìn)行高壓蒸汽滅菌后放置在無菌場所，固體培養(yǎng)液在40ºC左右瓊脂即將凝結(jié)前,，加入經(jīng)過過濾除菌的不耐熱溶液,，混勻后冷卻備用。液體培養(yǎng)液在冷卻到室溫后再加入過濾除菌溶液,。過濾除菌時,，使用孔徑為0.22～0.45μm或更小的細(xì)菌濾膜。過濾除菌可利用抽濾裝置或注射過濾器進(jìn)行,，所用器皿均應(yīng)進(jìn)行高壓消毒滅菌，溫度不應(yīng)超過121 ºC,。

3．玻璃器皿,、塑料器皿和器械滅菌
玻璃器皿可進(jìn)行干熱滅菌或高壓蒸汽滅菌，但在蒸汽滅菌后及時烘干水分,。對不能進(jìn)行高壓蒸汽滅菌的塑料器皿可用75%酒精浸泡,，使用前在無菌操作臺面上晾干的同時，用紫外線重復(fù)殺菌,。實(shí)驗(yàn)室還可以用環(huán)氧乙烷滅菌袋對塑料器皿進(jìn)行消毒,，消毒后的器皿要充分散氣2～4小時后才可使用。無菌操作所用的各種器械,，一般采用干熱或高壓蒸汽滅菌,，或用75%酒精浸泡，然后在無菌操作臺面上晾干的同時再用紫外線重復(fù)殺菌；在使用期間可多次對其進(jìn)行酒精燈火焰灼燒滅菌,。



4．培養(yǎng)材料的消毒滅菌
采自動物機(jī)體的實(shí)驗(yàn)材料,，攜帶著微生物及雜質(zhì)，接種前須進(jìn)行表面消毒滅菌,，對內(nèi)部已受微生物侵染的材料應(yīng)予以淘汰,。從動物機(jī)體采集的某些組織塊，須用消毒劑進(jìn)行浸泡處理,，進(jìn)行表面消毒,。常用消毒劑有過氧化氫（10~12%，浸泡5~15 min）,、過氧乙酸（0.05%,，浸泡30 s~1 min）、酒精（70~75%,，浸泡2 min）,。