蛋白雙向2D-WB電泳實(shí)驗(yàn)服務(wù)

實(shí)驗(yàn)技術(shù)簡介

2D-WB是雙向電泳與傳統(tǒng)western blot結(jié)合而成的一項(xiàng)技術(shù),。一般實(shí)驗(yàn)流程 為抗原蛋白混合物先經(jīng)雙向電泳分離,然后將凝膠蛋白轉(zhuǎn)印至支持膜上,，再通過抗體雜交顯色,。2D-WB技術(shù)可以檢測(cè)到抗原等電點(diǎn)或分子量發(fā)生的微小變化,，在蛋白翻譯后修飾的研究中有很好的應(yīng)用;而2D-WB結(jié)合質(zhì)譜鑒定技術(shù)，可以從蛋白混合物中找到免疫原性更強(qiáng)的抗原,。

2D Westerm blot概述

2D-WB是雙向電泳與傳統(tǒng)western blot結(jié)合而成的一項(xiàng)技術(shù),。一般實(shí)驗(yàn)流程 為抗原蛋白混合物先經(jīng)雙向電泳分離，然后將凝膠蛋白轉(zhuǎn)印至支持膜上,，再通過抗體雜交顯色,。2D-WB技術(shù)可以檢測(cè)到抗原等電點(diǎn)或分子量發(fā)生的微小變化，在蛋白翻譯后修飾的研究中有很好的應(yīng)用;而2D-WB結(jié)合質(zhì)譜鑒定技術(shù),，可以從蛋白混合物中找到免疫原性更強(qiáng)的抗原,。

2D Western blot技術(shù)服務(wù)內(nèi)容

1、蛋白質(zhì)抽提與定量;

2,、雙向電泳;

3,、轉(zhuǎn)膜，封閉,，孵育,顯示成像,。

實(shí)驗(yàn)操作流程

1、第--項(xiàng)電泳(IEF) ,膠條平衡,，第二項(xiàng)電泳SDS-APGE.

2,、第二項(xiàng)電泳結(jié)束后,，取出凝膠進(jìn)行轉(zhuǎn)膜，轉(zhuǎn)膜方法可選擇濕法轉(zhuǎn)移和半干法轉(zhuǎn)移,。常用的膜是NC膜和PVDF膜,。

3、封閉,，5%脫脂奶粉或5% BSA封閉1小時(shí)(室溫)或過夜(4度),。

4、-抗孵育,根據(jù)抗體說明書選擇孵育時(shí)間,，常規(guī)的孵育條件是室溫1小時(shí)或4度過夜,，-抗孵育后取出膜

TBST洗滌3次，每次5分鐘,。

5,、二抗孵育:根據(jù)一抗選擇合適的二抗(抗鼠、抗人,、抗兔等),，室溫孵育1小時(shí)后取出膜TBST洗滌3次,每次5分鐘。

6,、顯影:將A,、B底物按比例稀釋混臺(tái)均勻后滴在膜上，暗室中將膠片置于膜上,蓋上壓片夾,曝光一定時(shí)間后將膠片放入顯影液中進(jìn)行顯影,，直到出現(xiàn)清晰的蛋白質(zhì)條帶,，清水漂洗一下后在定影液中定影， 曝光時(shí)間需綜臺(tái)考慮蛋白質(zhì)的上樣量,，抗體稀釋濃度,，抗體孵育時(shí)間等因素。

7,、定影后,，清洗膠片，晾干,，標(biāo)定marker,掃描圖片和2D Western blot圖片分析,。

送樣須知,，為了保證2D Western blot技術(shù)服務(wù)能順利進(jìn)行,樣品寄送需滿足以下要求:

1,、顧客提供:組織、細(xì)胞,、蛋白質(zhì)溶液等; -抗(可交由研謹(jǐn)公司代購),。

2、運(yùn)輸要求:干冰或液氮包裝寄送,。

注:樣本應(yīng)避免各類污染和反復(fù)凍融,。

2D Western blot技術(shù)服務(wù)報(bào)告內(nèi)容

1,、蛋白質(zhì)定量結(jié)果及電泳上樣量;

2、原始膠片,、電子圖片及圖片分析結(jié)果;

3,、2D Western blot完整的實(shí)驗(yàn)報(bào)告，包括實(shí)驗(yàn)步驟,、使用儀器和試劑等,。

附: 2D Western blot實(shí)驗(yàn)步驟

1、2D Western blot蛋白質(zhì)樣本制備,制備的主要原則是盡可能溶解全部蛋白質(zhì),，破壞蛋白質(zhì)與蛋白質(zhì)間的相互作用,，避免各類干擾物質(zhì)，樣品制備與IEF兼容等,。

2,、雙向電泳的主要步驟，第-項(xiàng)電(IEF) ,，膠條平衡,，第二項(xiàng)電泳SDS-APGE.

3、第二項(xiàng)電泳結(jié)束后,，取出凝膠進(jìn)行轉(zhuǎn)膜,，轉(zhuǎn)膜方法可選擇濕法轉(zhuǎn)移和半干法轉(zhuǎn)移。常用的膜是NC膜和PVDF膜,。

4,、封閉， 5%脫脂奶粉或5% BSA封閉1小時(shí)(室溫)或過夜(4度),。

5,、一抗孵育,根據(jù)抗體說明書選擇孵育時(shí)間，常規(guī)的孵育條件是室溫1小時(shí)或4度過夜,，一 抗孵育后取出膜TBST洗滌3次,，每次5分鐘。

6,、二抗孵育:根據(jù)-抗選擇合適的二抗(抗鼠,、抗人抗兔等)， 室溫孵育1小時(shí)后取出膜TBST洗滌3次,，每次5分鐘,。

7、顯影:將A,、B底物按比例稀釋混合均勻后滴在膜上,暗室中將膠片置于膜上,，蓋上壓片夾，曝光一定時(shí)間后將膠片放入顯影液中進(jìn)行顯影,，直到出現(xiàn)清晰的蛋白質(zhì)條帶,，清水漂洗一下后在定影液中定影,， 曝

光時(shí)間需綜合考慮蛋白質(zhì)的.上樣量，抗體稀釋濃度,，抗體孵育時(shí)間等因素,。

8、定影后,，清洗膠片,，晾干，標(biāo)定marker,掃描圖片和2D Western blot圖片分析,。

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