提供商:    上海研謹(jǐn)生物

服務(wù)名稱:        單克隆抗體制備服務(wù)

規(guī)格:               實驗服務(wù) 

單克隆抗體(MAb)是針專- -的抗原決定簇產(chǎn)生的抗體,，單克隆技術(shù)又名雜交瘤技術(shù)起源于1975年，由G. KOhler和Milstein創(chuàng)立,。主要原理是利用產(chǎn)生抗體的B細胞與腫瘤細胞雜交融合成雜交瘤細胞,，生產(chǎn)抗體。

雜交瘤技術(shù)制備單克隆抗是針對體的主要步驟包括:

(1 )抗原制備,，

(2)免疫動物,

(3)免疫脾細胞和骨髓瘤細胞的制備,

(4)細胞融合;

(5)雜交瘤細胞的選擇培養(yǎng),，

(6)雜交瘤細胞的篩選;

(7)雜交瘤細胞的克隆化;

(8)單克隆抗體的檢定;

(9)分泌單克隆抗體雜交瘤細胞系的建立:

(10)單克隆抗體的大量制備。

下面簡要介紹單克隆抗體的制備過程:

1,、免疫動物免疫動物是用目的抗原免疫小鼠,，使小鼠產(chǎn)生致敏B淋巴細胞的過程。一般選用6- 8周齡雌性Balb/c小鼠,，按照預(yù)先制定的免疫方案進行免疫注射,?？乖ㄟ^血液循環(huán)或淋巴循環(huán)進入外周免疫器官，刺激相應(yīng)B淋巴細胞克隆,，使其活化,、增殖，并分化成為致敏B淋巴細胞,。

2,、細胞融合采用眼球摘除放血法處死小鼠，無菌操作取出脾臟,，在平皿內(nèi)擠壓研磨,，制備脾細胞懸液。將準(zhǔn)備好的同系骨髓瘤細胞與小鼠脾細胞按一定比例混合, 并加入促融合劑聚乙二醇,。在聚乙二醇作下,，各種淋巴細胞可與骨髓瘤細胞發(fā)生融合，形成雜交瘤細胞,。

3,、選擇性培養(yǎng)選擇性培養(yǎng)的目的是篩選融臺的雜交瘤細胞，一般采用HAT選擇性培養(yǎng)基,。 在HAT培養(yǎng)基中,，未融合的骨髓瘤細胞因缺乏次黃嘌呤鳥嘌呤磷酸核糖轉(zhuǎn)移酶，不能利用補救途徑合成DNA而死亡,。未融臺的淋巴細胞雖具有次黃嘌呤鳥嘌呤磷酸核糖轉(zhuǎn)移酶,，但其本身不能在體外長期存活也逐漸死亡。只有融合的雜交瘤細胞由于從脾細胞獲得 了次黃嘌呤鳥嘌呤磷酸核糖轉(zhuǎn)移酶,，并具有骨髓瘤細胞能無限增殖的特性,，因此能在HAT培養(yǎng)基中存活和增殖。

4,、雜交瘤陽性克隆的篩選與克隆化在HAT培養(yǎng)基中生長的雜交瘤細胞，只有少數(shù)是分泌預(yù)定特異性單克隆抗體的細胞,，因此,，必須進行篩選和克隆化。通常采用有限稀釋法進行雜交瘤細胞的克隆化培養(yǎng),。采用靈敏,、快速、特異的免疫學(xué)方法,，篩選出能產(chǎn)生所需單克隆抗體的陽性雜交瘤細胞,，并進行克隆擴增。

經(jīng)過全面鑒定其所分泌單克隆抗體的免疫球蛋白類型,、亞類,、特異性,、親和力、識別抗原的表位及其分子后,，及時進行凍存,。

5、單克隆抗體的大量制備單克隆抗體的大量制備重要采用動物體內(nèi)誘生法和體外培養(yǎng)法,。

(1)體內(nèi)誘生法取Balb/c小鼠,，首先腹腔注射0. 5ml液體石臘或降植烷進行預(yù)處理。1-2周后,，腹腔內(nèi)接種雜交瘤細胞,。雜交瘤細胞在小鼠腹腔內(nèi)增殖，并產(chǎn)生和分泌單克隆抗體,。約1-2周,，可見小鼠腹部膨大,。用注射器抽取腹水,，即可獲得大量單克隆抗體。

(2)體外培養(yǎng)法將雜交瘤細胞置于培養(yǎng)瓶中進行培養(yǎng),。在培養(yǎng)過程中,，雜交瘤細胞產(chǎn)生并分泌單克隆抗體,，收集培養(yǎng)上清液，離心去除細胞及其碎片,，即可獲得所需要的單克隆抗體。但這種方法產(chǎn)生的抗體量有限,。近年來,各種新型培養(yǎng)技術(shù)和裝置不斷出現(xiàn)，大大提高了抗體的生產(chǎn)量,。雜交瘤細胞融合后,，要進行篩選后才能使用,。雜交瘤細胞分為兩次:一、篩選出雜交瘤細胞;二,、 在初選的雜交瘤細胞中篩選出能產(chǎn)生特異性抗體的雜交瘤細胞,，這兩次篩選的方法和原理各不相同。

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