細(xì)胞生長曲線的測定實(shí)驗(yàn)?zāi)康?/span>：

掌握繪制細(xì)胞生長曲線的原理和方法。

細(xì)胞生長曲線的測定背景與原理：

生長曲線是測定細(xì)胞生長數(shù)的常用方法,，也是判定細(xì)胞活力的重要指標(biāo),，是培養(yǎng)細(xì)胞生物學(xué)特性的基本參數(shù)之一。--般細(xì)胞傳代之后,，經(jīng)過短暫的懸浮后貼壁,，隨后渡過長短不同的潛伏期，即進(jìn)入快速生長的指數(shù)生長期,。在細(xì)胞達(dá)到飽和密度后,，停止生長，進(jìn)入平臺(tái)期,，然后退化衰亡,。為了準(zhǔn)確描述整個(gè)過程中細(xì)胞數(shù)目的動(dòng)態(tài)變化，需連續(xù)對(duì)細(xì)胞進(jìn)行計(jì)數(shù),。通常計(jì)數(shù)6天,。為精確起見，一般每次實(shí)驗(yàn)設(shè)3個(gè)平行重復(fù),。

[材料,、試劑與儀器]

1、實(shí)驗(yàn)材料:

Hela細(xì)胞系,。

2,、實(shí)驗(yàn)試劑:

DMEM培養(yǎng)基(青霉素，鏈霉素,，10%血清) ,，0.25%胰蛋白酶溶液， 臺(tái)酚藍(lán)染液,。

3,、實(shí)驗(yàn)儀器:

超凈工作臺(tái)，CO2培養(yǎng)箱,，倒置顯微鏡,，微量移液器,，血細(xì)胞計(jì)數(shù)板，培養(yǎng)瓶,，離心管,移液管,，廢液缸，蓋玻片, 24孔板,。

[方法與步驟]

1,、取生長良好的細(xì)胞，用培養(yǎng)基制成細(xì)胞懸液后計(jì)數(shù),。根據(jù)細(xì)胞計(jì)數(shù)結(jié)果按5x104/mL作傳代培養(yǎng)接種于24孔板中,，共接種21孔細(xì)胞。1 m/孔,。余下三孔可設(shè)傳代培養(yǎng)的對(duì)照,。

2、24h后每天記錄細(xì)胞數(shù)目,，每次取3孔細(xì)胞,，分別進(jìn)行計(jì)數(shù)。計(jì)算平均值,。連續(xù)計(jì)數(shù)7d,。細(xì)胞用胰酶消化后加入一定量的培養(yǎng)基,混勻制成細(xì)胞懸液。取少量懸液與臺(tái)酚藍(lán)1:1混臺(tái),。取一干凈的血細(xì)胞計(jì)數(shù)板,蓋上蓋片,，從蓋片兩邊滴入細(xì)胞懸液使之充滿計(jì)數(shù)板和蓋片之間。注意滴液勿有氣泡,，也不能太多,，否則會(huì)使蓋片浮起而使細(xì)胞計(jì)數(shù)不準(zhǔn)。

3,、低倍鏡下觀察,，活細(xì)胞不著色，臺(tái)盼藍(lán)著色的細(xì)胞呈深藍(lán)色,，是不健康或已死亡的細(xì)胞,，不能計(jì)數(shù)。

找出計(jì)數(shù)板上的方格,，計(jì)算四角大格內(nèi)總細(xì)胞數(shù),，大格線者只計(jì)左側(cè)和上方，不計(jì)右側(cè)和下方細(xì)胞懸液中細(xì)胞

密度計(jì)算公式為:細(xì)胞數(shù)/mL= (四角大格內(nèi)細(xì)胞數(shù)/4) x104x2

4,、根據(jù)細(xì)胞計(jì)數(shù)結(jié)果,，以單位細(xì)胞數(shù)(細(xì)胞數(shù)/mL)為縱坐標(biāo)，以時(shí)間為橫坐標(biāo)繪制生長曲線。

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