胰糜蛋白酶的制備
【實驗目的】 :掌握從組織中制備胰糜蛋白酶的原理和方法,。
【實驗原理】 :胰糜蛋白酶是胰腺產(chǎn)生的一種消化酶,。初以酶原的形式被合成與分泌,之后在胰蛋白酶的作用下被水解而激活。胰糜蛋白酶是一種催化肽鍵的肽鏈內(nèi)切酶,,主要切斷色氨酸,、苯丙氨酸或酪氨酸的羧基側(cè)肽鍵。
酶絕大多數(shù)都是蛋白質(zhì),,因此一般提純蛋白質(zhì)的方法也適用于酶的提純,,所不同的是在提純酶的過程中要不斷地進行酶活力的檢測,本實驗主要涉及提取過程,。
【實驗藥品與器材】
(一)材料和試劑
1.主要材料:新鮮豬胰臟1個,。
2.主要試劑:
2.5mol/LH2SO4溶液,固體(NH4)2SO4,,氯化鈣粉,,1%酪蛋白溶液,)0.1mol/LpH7.4磷酸鹽緩沖液,,1%BaCl2溶液,,5mol/LNaOH溶液。
(二)主要器材
組織搗碎機,、手術器械、紗布,、漏斗,、透析袋、離心機,、燒杯,、pH計、離心管,。
【實驗方法與步驟】
1.提取取新鮮豬胰臟,,放在盛有冰冷2.5mol/LH2SO4溶液的容器中,保存在冰箱中待用,。去除胰臟表面的脂肪和結(jié)締組織后,,稱重。用組織搗碎機粉碎,。然后混懸于兩倍體積的冰冷2.5mol/LH2SO4溶液中,,置于冰箱中過夜。將上述混懸液以3000rpm離心10min,,上層液經(jīng)兩層紗布過濾燒杯中,;將沉淀再混懸于等體積的冰冷2.5mol/LH2SO4溶液中,再離心,,將兩次上層液合并,,即為提取液。此時可留樣測酶的活力,。
2.分離,。
3.結(jié)晶取分離所得的胰糜蛋白酶溶于3倍體積的水中(此時可取0.5ml留樣測酶活力),,加(NH4)2SO4(1.44g/10ml),用5mol/LNaOH溶液調(diào)pH6.0,,在室溫放置12h即可出現(xiàn)結(jié)晶,,在顯微鏡下觀察結(jié)晶形狀。
【注意事項】
1.整個操作過程在0℃~5℃條件下進行,。
2.實驗材料應采用新鮮胰組織,。
3.分清實驗過程中每次離心后各保留的是上清液,還是沉淀,。
4.離子強度,、pH、溫度,、試管的潔凈度等均可影響酶的活性,,如需進一步進行活性測定,務必保證固定的實驗條件,,嚴格按照程序操作,。
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