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胰糜蛋白酶的制備
【實(shí)驗(yàn)?zāi)康摹?nbsp; :掌握從組織中制備胰糜蛋白酶的原理和方法,。
【實(shí)驗(yàn)原理】 :胰糜蛋白酶是胰腺產(chǎn)生的一種消化酶,。初以酶原的形式被合成與分泌,之后在胰蛋白酶的作用下被水解而激活,。胰糜蛋白酶是一種催化肽鍵的肽鏈內(nèi)切酶,,主要切斷色氨酸、苯丙氨酸或酪氨酸的羧基側(cè)肽鍵,。
酶絕大多數(shù)都是蛋白質(zhì),,因此一般提純蛋白質(zhì)的方法也適用于酶的提純,所不同的是在提純酶的過(guò)程中要不斷地進(jìn)行酶活力的檢測(cè),,本實(shí)驗(yàn)主要涉及提取過(guò)程,。
【實(shí)驗(yàn)藥品與器材】
(一)材料和試劑
1.主要材料:新鮮豬胰臟1個(gè)。
2.主要試劑:
2.5mol/LH2SO4溶液,,固體(NH4)2SO4,,氯化鈣粉,1%酪蛋白溶液,,)0.1mol/LpH7.4磷酸鹽緩沖液,,1%BaCl2溶液,5mol/LNaOH溶液,。
(二)主要器材
組織搗碎機(jī)、手術(shù)器械,、紗布,、漏斗、透析袋,、離心機(jī),、燒杯、pH計(jì),、離心管,。
【實(shí)驗(yàn)方法與步驟】
1.提取取新鮮豬胰臟,放在盛有冰冷2.5mol/LH2SO4溶液的容器中,,保存在冰箱中待用,。去除胰臟表面的脂肪和結(jié)締組織后,稱(chēng)重,。用組織搗碎機(jī)粉碎,。然后混懸于兩倍體積的冰冷2.5mol/LH2SO4溶液中,置于冰箱中過(guò)夜,。將上述混懸液以3000rpm離心10min,,上層液經(jīng)兩層紗布過(guò)濾燒杯中;將沉淀再混懸于等體積的冰冷2.5mol/LH2SO4溶液中,,再離心,,將兩次上層液合并,即為提取液。此時(shí)可留樣測(cè)酶的活力,。
2.分離,。
3.結(jié)晶取分離所得的胰糜蛋白酶溶于3倍體積的水中(此時(shí)可取0.5ml留樣測(cè)酶活力),加(NH4)2SO4(1.44g/10ml),,用5mol/LNaOH溶液調(diào)pH6.0,,在室溫放置12h即可出現(xiàn)結(jié)晶,在顯微鏡下觀察結(jié)晶形狀,。
【注意事項(xiàng)】
1.整個(gè)操作過(guò)程在0℃~5℃條件下進(jìn)行,。
2.實(shí)驗(yàn)材料應(yīng)采用新鮮胰組織。
3.分清實(shí)驗(yàn)過(guò)程中每次離心后各保留的是上清液,,還是沉淀,。
4.離子強(qiáng)度、pH,、溫度,、試管的潔凈度等均可影響酶的活性,如需進(jìn)一步進(jìn)行活性測(cè)定,,務(wù)必保證固定的實(shí)驗(yàn)條件,,嚴(yán)格按照程序操作。
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