細(xì)胞培養(yǎng)基的基本成分
在一些較為復(fù)雜的培養(yǎng)液中還包括其它一些成分。如在雜交瘤技術(shù)中常用的DMEM 培養(yǎng)液,,使用時還需要補加丙酮酸鈉(2-Mercaptoethanol,,2-Me)。2-Me 對細(xì)胞生長有很重要的作用,。有人認(rèn)為它相當(dāng)于胎牛血清,,有直接刺激細(xì)胞增殖作用。2-Me的活性部分是硫氫基,,其中一個重要作用是使血清中含硫的化合物還原成谷胱甘肽,,能誘導(dǎo)細(xì)胞的增殖,為非特異性的激活作用,。同時避免過氧化物對培養(yǎng)細(xì)胞的損害,。另一個重要作用是促進(jìn)分裂原的反應(yīng)和DNA 合成,增加植物凝集素(PHA)對淋巴細(xì)胞的轉(zhuǎn)化作用,,已廣泛應(yīng)用于雜交瘤技術(shù),,另外,也開始用于一些難以培養(yǎng)的細(xì)胞,。2-Me 是一種小分子還原劑,,極易氧化。分子量為78.13,,純的2-Me 是一種無色有刺激味的液體,,比重為1.110-1.120(Do20),常用終濃度為5×10-5M,。常配制成0.1M 的儲存液,,用時每升培養(yǎng)液加0.5ml。
液體培養(yǎng)基保存
液體培養(yǎng)基應(yīng)于4℃冰箱避光保存,,實驗前放入37℃預(yù)熱,。未加血清液體培養(yǎng)基有效期為12 個月,。液體培養(yǎng)基中的L-谷氨酰胺會隨著儲存時間的延長而慢慢分解。如果細(xì)胞生長不良,,可以再添加適量L-谷氨酰胺,。
干粉培養(yǎng)基保存
4℃冰箱避光保存,有效期36 個月,。
血清
細(xì)胞培養(yǎng)液中添加的血清有牛血清,、馬血清、人血清等,,其中牛血清是常用的血清,,分為胎牛血清和新生小牛血清。胎牛血清是從母牛破腹取出的胎牛中分離出的血清,,價格昂貴,。新生小牛血清是從剛出生的尚未哺乳的小牛中分離出來的血清,如廠家能做到這一點,,新生小牛血清的質(zhì)量與胎牛血清的質(zhì)量相差不大,。如小牛出生后已哺乳,從這種小牛中取出的血清中可能含有較多的生物活性物質(zhì),,其質(zhì)量明顯不如前兩種,。
血清的質(zhì)量,種類及使用的濃度都有可能影響細(xì)胞的生長,,而不同批次的血清支持細(xì)胞生長的能力也不同,,尤其是對克隆細(xì)胞的生長,某些批次血清可能含有毒性或抑制細(xì)胞生長的物質(zhì),。因此,,在購買大量血清之前,必須對血清支持細(xì)胞生長能力進(jìn)行檢測,,然后再大量購買質(zhì)量好的同一批號的血清,,并注意以下幾點:
(1)需要長期保存的血清必須儲存于-20℃ – 70℃ 低溫冰箱中。4℃冰箱中保存時間切勿超過1 個月,。由于血清結(jié)冰時體積會增加約10%,,因此,血清在凍入低溫冰箱前,,必須預(yù)留一定體積空間,,否則易發(fā)生污染或玻璃瓶凍裂。
(2)一般廠商提供的血清為無菌,,無需再過濾除菌,。如發(fā)現(xiàn)血清有懸浮物,則可將血清加入培養(yǎng)液內(nèi)一起過濾,,切勿直接過濾血清,。
(3)瓶裝血清解凍需采用逐步解凍法:-20℃ -70℃ 低溫冰箱中的血清放入4℃冰箱中溶解1 天,。然后移入室溫,待全部溶解后再分裝,。在溶解過程中需不斷輕輕搖晃均勻(小心勿造成氣泡),,使溫度與成分均一,減少沉淀的發(fā)生,。切勿直接將血清從-20℃進(jìn)入37℃解凍,,這樣因溫度改變太大,容易造成蛋白質(zhì)凝集而出現(xiàn)沉淀,。
(4)熱滅活是指56℃, 30 分鐘加熱已*解凍的血清,。加熱過程中須規(guī)則搖晃均勻。此熱處理的目的是使血清中的補體成分(complement)滅活,。除非必須,,一般不建議作此熱處理,,因為熱處理會造成血清沉淀物顯著增多,,而且還會影響血清的質(zhì)量。補體參與反應(yīng)有:細(xì)胞毒作用, 平滑肌細(xì)胞收縮, 肥大細(xì)胞和血小板釋放組胺, 增強吞噬作用, 促進(jìn)淋巴細(xì)胞和巨噬細(xì)胞發(fā)生化學(xué)趨化和活化,。
(5)切勿將血清在37℃放置太久,,否則血清會變得渾濁,同時血清中的有效成分會破會而影響血清質(zhì)量,。
(6)血清中的沉淀物
絮狀物:主要是血清中的脂蛋白變性及解凍后血清中纖維蛋白造成,,這些絮狀物不會影響血清本身的質(zhì)量??捎秒x心3000rpm, 5 分鐘去除,,也可不用處理。
顯微鏡下“小黑點”:經(jīng)過熱處理過的血清,,沉淀物的形成會顯著增多,。有些沉淀物在顯微鏡下觀察象“小黑點”,常誤認(rèn)為血清受污染,。一般情況下,,此小黑點不會影響細(xì)胞生長,但如果懷疑血清質(zhì)量,,則應(yīng)立即停止使用,,更換另一批號的血清。
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