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關(guān)鍵詞：Ⅰ型5α-還原酶,，Ⅱ型5α-還原酶，肝5α-還原酶,，睪丸5α-還原酶,，睪酮，二氫睪酮,，還原型輔酶Ⅱ(NADPH),，非那雄胺，化妝品控油功效,，5α-Reductase,，5αR1，5αR2,，SRD5A1,，SRD5A2，Testosterone,，Dihydrotestosterone(DHT),，F(xiàn)inasteride

隨著化妝品行業(yè)的功效細(xì)分，功效宣稱的規(guī)范,，消費(fèi)者對(duì)自己皮膚的狀態(tài)越來越關(guān)注,，針對(duì)不同膚質(zhì)也會(huì)選擇不同功效的護(hù)膚品。當(dāng)前,，皮膚油膩逐漸成為困擾年輕人的主要問題,，消費(fèi)者對(duì)于具有控油功效的化妝品的需求呈現(xiàn)日益增長(zhǎng)的趨勢(shì)。皮膚油膩與皮脂腺細(xì)胞過度分泌油脂有關(guān),，其中,，5α-還原酶（5α-Reductase）是皮膚油脂分泌的一個(gè)關(guān)鍵限速酶，其活性與皮脂腺的油脂分泌情況有著緊密的聯(lián)系,?；瘖y品功效成分如果能夠抑制5α-還原酶活性，則能有效地調(diào)節(jié)皮脂腺細(xì)胞的活性,，減少油脂的分泌,，從而起到控油的作用。因此,，5α-還原酶活性抑制試驗(yàn)是評(píng)價(jià)化妝品控油功效的關(guān)鍵指標(biāo),。

01    5α-還原酶簡(jiǎn)介

5α-還原酶（5α-Reductase,，5αR）是定位于靶細(xì)胞微粒體上的膜蛋白，是雄激素睪酮( Testosterone,T)代謝的關(guān)鍵酶,，共包含Ⅰ型（SRD5A1）,、Ⅱ型（SRD5A2）和Ⅲ型（SRD5A3）三種同工酶。其中,，Ⅰ型5α-還原酶（5αR1）主要分布于肝臟,、皮脂腺、汗腺等器官,，發(fā)揮生理作用的最適pH為6~9,；Ⅱ型5α-還原酶（5αR2）主要分布于前列腺、睪丸,、附睪,、精囊、頭皮毛囊等,，作用最適pH為5.5,；而Ⅲ型5α-還原酶（5αR3）研究較少，其在難治愈的前列腺癌中過度表達(dá),。

5αR可在還原型輔酶Ⅱ(NADPH) 提供電子的條件下將睪酮上4,、5位不飽和雙鍵還原，并轉(zhuǎn)化為更具活性的二氫睪酮（Dihydrotestosterone,，DHT）,。二氫睪酮作為一種比睪酮更強(qiáng)效的雄激素，可加速人皮脂腺細(xì)胞的增殖并促使皮脂分泌亢進(jìn),，易導(dǎo)致皮膚油膩等問題（圖1）出現(xiàn),，給人們帶來巨大的心理壓力, 影響工作與生活。因此,，通過抑制5α-還原酶的活性以減少皮脂分泌來評(píng)價(jià)化妝品控油功效,，并將其運(yùn)用于控油、痤瘡等醫(yī)藥健康產(chǎn)品領(lǐng)域,，其具有重要的研究?jī)r(jià)值和廣闊的市場(chǎng)前景,。

圖1 5α-還原酶在皮膚油脂分泌中的作用（來源：基于人5α還原酶活性試驗(yàn)對(duì)化妝品控油原料的篩選）

02    5α-還原酶活性抑制試驗(yàn)與化妝品控油功效評(píng)價(jià)

根據(jù)化妝品功效宣稱評(píng)價(jià)項(xiàng)目要求（表1），控油功效宣稱評(píng)價(jià)方法有三種：人體功效評(píng)價(jià)試驗(yàn),、消費(fèi)者使用測(cè)試和實(shí)驗(yàn)室試驗(yàn)方法,，配以文獻(xiàn)數(shù)據(jù)支持。其中人體功效和消費(fèi)者測(cè)試這兩種方法為人體方法,，所需的成本高,，周期長(zhǎng)。目前市場(chǎng)上認(rèn)可最多的就是體外實(shí)驗(yàn)室試驗(yàn)法,，實(shí)驗(yàn)室試驗(yàn)認(rèn)可的方法有：皮脂腺細(xì)胞試驗(yàn)和5α-還原酶活性抑制試驗(yàn),。

皮脂腺細(xì)胞試驗(yàn)由于細(xì)胞的特性，不宜用低毒性或者高于低毒性的化妝品進(jìn)行檢測(cè),，易使細(xì)胞失去活性,。因此：5α-還原酶活性抑制試驗(yàn)是化妝品控油功效評(píng)價(jià)最常使用的方案。

表1 化妝品功效宣稱評(píng)價(jià)項(xiàng)目要求

03    IPHASE相關(guān)產(chǎn)品

5α-還原酶活性抑制的體外評(píng)估方法通常有紫外法、液相色譜-質(zhì)譜（LC-MS）法,、酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)（ELISA）法,、放射性同位素法、熒光法等,。其中LC-MS法,、同位素法和ELISA法靈敏度高，均可準(zhǔn)確測(cè)定5αR活性,，但價(jià)格昂貴,，對(duì)試驗(yàn)人員操作技能要求較高；紫外法雖操作簡(jiǎn)單,，但測(cè)定的目標(biāo)物NADPH對(duì)5αR并無專一性,，易受到其他酶的干擾而造成檢測(cè)偏差。

鑒于此,，IPHASE技術(shù)人員建立了一種基于可見分光光度法的5α-還原酶活性抑制效果體外評(píng)估的方法,，該方法基于酶循環(huán)原理，提高了檢測(cè)靈敏度和特異性,。該方法涉及兩步反應(yīng),，首先5α-還原酶將睪酮代謝為5α-二氫睪酮,，接著二氫睪酮在酶的作用下繼續(xù)反應(yīng)，此反應(yīng)過程中生成的產(chǎn)物在405nm波長(zhǎng)處有特異性的峰值,，通過檢測(cè)該產(chǎn)物在405nm波長(zhǎng)處的吸光度變化,，用來體現(xiàn)二氫睪酮生成的多少，最終反映5α-還原酶的活性變化,，從而評(píng)估化合物的抑制效果（圖2）,。由于檢測(cè)產(chǎn)物在405nm處有特異性的吸收峰，因此不受其他物質(zhì)的吸光度的干擾,，提高了檢測(cè)特異性,。

圖2 基于可見分光光度法的5α-還原酶活性檢測(cè)原理

此外，為更好地滿足不同客戶的需求,，IPHASE技術(shù)人員在此方法基礎(chǔ)上根據(jù)5α-還原酶的類型開發(fā)出Ⅰ型(SRD5A1)5α-還原酶抑制率評(píng)估試劑盒和Ⅱ型(SRD5A2)5α-還原酶抑制率評(píng)估試劑盒,，可分別用于Ⅰ型5α-還原酶和Ⅱ型5α-還原酶抑制劑的篩選。

兩種試劑盒的不同主要體現(xiàn)在酶的來源和陽性藥物的選擇上,，其中,，Ⅰ型試劑盒為SD大鼠肝5α-還原酶和度他雄胺（Dutasteride），Ⅱ型試劑盒為SD大鼠睪丸5α-還原酶和非那雄胺（Finasteride）,。此外,，試劑盒還包括了睪酮T、NADPH溶液,、酶制劑及反應(yīng)緩沖液等成分,，以確保用戶能夠輕松建立反應(yīng)體系并進(jìn)行檢測(cè)。試劑盒中各組成成分經(jīng)過嚴(yán)格的質(zhì)量檢測(cè),，試驗(yàn)結(jié)果準(zhǔn)確,、可靠、重現(xiàn)性好,。

IPHASE技術(shù)人員對(duì)陽性抑制劑非那雄胺的抑制效果進(jìn)行評(píng)估,，根據(jù)試劑盒說明書進(jìn)行操作，試驗(yàn)體系中非那雄胺終濃度為62.5ug/ml,，睪酮終濃度為5uM,，SD大鼠睪丸5α-還原酶終濃度為0.2mg/ml，第一步反應(yīng)孵育時(shí)間為30min,，第二步反應(yīng)的孵育時(shí)間為4min,。第二步反應(yīng)后，用酶標(biāo)儀檢測(cè)各組別在405nm處的的吸光度值：

按照下列公式進(jìn)行抑制率的計(jì)算：

代入數(shù)值,，可得出非那雄胺的抑制率為：

注：陽性對(duì)照樣本的抑制率在70%以上,，試驗(yàn)成立。

因此,，在試驗(yàn)初期,，本試劑盒提供的方法可作為化合物高通量初篩的一種手段,，簡(jiǎn)便、高效,，試驗(yàn)結(jié)果準(zhǔn)確,、可靠。

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