iTRAQ標(biāo)簽技術(shù)如何用于肽組學(xué)分析？檢測技術(shù)服務(wù)詳情介紹

在肽組學(xué)分析中,，質(zhì)譜技術(shù)通常用于識別樣本中天然存在的內(nèi)源性肽段,。然而，僅靠“是否存在”遠(yuǎn)遠(yuǎn)不足以揭示疾病機(jī)制或發(fā)現(xiàn)生物標(biāo)志物,。定量分析,，尤其是多樣本之間的差異表達(dá)比較，是理解病理變化、尋找潛在靶點(diǎn)的關(guān)鍵,。iTRAQ標(biāo)簽技術(shù)（Isobaric Tags for Relative and Absolute Quantification）,，不僅廣泛應(yīng)用于蛋白組學(xué)，在特定肽組學(xué)研究中也正發(fā)揮重要作用,。

一,、什么是iTRAQ標(biāo)簽技術(shù)？原理與優(yōu)勢簡析

iTRAQ是一種基于等重同位素標(biāo)記的多通道相對定量技術(shù),，通過將不同樣本的肽段打上“質(zhì)量相同但碎裂后可區(qū)分”的標(biāo)簽,，使得多個樣本可在同一次質(zhì)譜分析中并行比對、定量分析,。

1,、iTRAQ技術(shù)核心特點(diǎn)：

（1）多重標(biāo)簽：支持4-plex、8-plex,，zuì多可實現(xiàn)8組樣本并行分析

（2）等質(zhì)量標(biāo)記：標(biāo)簽本身不影響色譜分離或MS1質(zhì)量數(shù)峰

（3）MS/MS級定量：在二級質(zhì)譜中釋放出各標(biāo)簽tèyǒu的報告離子,，用于相對定量

百泰派克生物科技常用的iTRAQ 8-plex平臺，適用于比較多個樣本組（如疾病亞型,、干預(yù)前后,、生理狀態(tài)差異）下的肽段表達(dá)譜，為高通量篩選提供高效工具,。

二,、實驗流程詳解：iTRAQ標(biāo)簽技術(shù)在肽組學(xué)分析中的標(biāo)準(zhǔn)操作路徑

1、樣本收集與總蛋白/肽段提取

根據(jù)研究目標(biāo)和樣本類型（組織,、血清,、尿液、腦脊液等）,，選擇不同的肽段提取策略：

（1）樣本來源

• 細(xì)胞/組織：使用冷PBS清洗,，避免蛋白降解

• 體液樣本：加入蛋白酶抑制劑，盡快離心除去細(xì)胞碎片

（2）肽段提取方法

• 內(nèi)源肽組學(xué)研究：采用分子量截留（<10 kDa）,、固相萃取或C18磁珠富集

• 可控酶解策略（如酶解短肽組）：適用于結(jié)合蛋白表達(dá)調(diào)控與功能片段研究

所有操作均在低溫/保護(hù)環(huán)境下進(jìn)行,，以zuì大限度保持肽段結(jié)構(gòu)與修飾狀態(tài)。

2,、iTRAQ標(biāo)簽標(biāo)記

（1）標(biāo)簽原理

每種iTRAQ標(biāo)簽包含三個部分：

• 報告基團(tuán)（Reporter group）：在MS/MS中釋放出可識別的離子（如114,、115,、116等）

• 平衡基團(tuán)（Balance group）：調(diào)節(jié)標(biāo)簽質(zhì)量,，總質(zhì)量相同

• 反應(yīng)基團(tuán)（Reactive group）：與肽段N-末端和賴氨酸側(cè)鏈共價結(jié)合

（2）標(biāo)記流程

• 定量上樣：每個樣本嚴(yán)格定量至相同肽段總量（建議100 µg以上）

• 干燥重懸：用iTRAQ專用緩沖液重懸，避免使用含氨緩沖液（如Tris）

• 標(biāo)簽反應(yīng)：加入各自的iTRAQ試劑,，在37℃反應(yīng)1-2小時

• 反應(yīng)終止：加入去反應(yīng)液抑制殘余iTRAQ活性

• 樣本混合：所有標(biāo)簽組分按照1:1比例混合,，混合后統(tǒng)一進(jìn)入后續(xù)處理

若富集前進(jìn)行標(biāo)記操作，則需確保肽段N末端未被封閉或修飾，保證標(biāo)簽結(jié)合效率,。

3,、清洗、分級與樣品處理

為了降低樣本復(fù)雜度,、提高質(zhì)譜靈敏度,，通常在質(zhì)譜分析前進(jìn)行如下步驟：

（1）清洗步驟

• C18 SPE固相萃取柱：去除鹽離子、標(biāo)簽副產(chǎn)物等干擾物

• 磁珠富集（可選）：進(jìn)一步集中目標(biāo)分子量段的肽段

（2）分級策略（推薦）

• 使用高pH反相液相色譜（High-pH RPLC）對混合樣本進(jìn)行預(yù)分離

• 將混合樣本拆分為多個組分（如8~12組）,，降低復(fù)雜度,，提高肽段識別數(shù)量

4、LC-MS/MS質(zhì)譜分析

（1）分析平臺

• 納升級液相色譜系統(tǒng)（nanoLC）+ 高分辨質(zhì)譜平臺（如Orbitrap Exploris 480）

• MS/MS模式采用 HCD碎裂,，可準(zhǔn)確釋放iTRAQ報告離子

（2）采集策略

• 常用DDA模式進(jìn)行肽段鑒定與定量

• 可擴(kuò)展至DIA,、PRM模式以增強(qiáng)重復(fù)性與靶向驗證能力

5、數(shù)據(jù)解析與定量分析

百泰派克使用zhuānyè軟件與自建數(shù)據(jù)庫,，進(jìn)行以下關(guān)鍵分析步驟：

（1）肽段鑒定

使用如Proteome Discoverer,、MaxQuant、PEAKS等軟件比對MS/MS譜圖

支持UniProt,、RefSeq,、Ensembl等數(shù)據(jù)庫對接

（2）標(biāo)簽離子強(qiáng)度提取

提取每個肽段的iTRAQ報告離子峰強(qiáng)，計算相對豐度比值

扣除背景噪聲與標(biāo)簽泄漏（cross-talk）影響

（3）統(tǒng)計分析

差異肽段篩選（Fold Change,、p值,、FDR）

熱圖、PCA,、聚類,、火山圖可視化表達(dá)譜

（4）功能富集與通路注釋

將差異肽段回溯至來源蛋白，結(jié)合GO,、KEGG,、Reactome通路分析

可支持后續(xù)驗證標(biāo)志物預(yù)測、機(jī)制解析等需求

三,、iTRAQ標(biāo)簽技術(shù)能否用于肽組學(xué)分析,？——答案是“有條件地可以”

iTRAQ主要用于蛋白組學(xué)中的酶解肽段分析，但在特定肽組學(xué)研究中,，iTRAQ也可用于對內(nèi)源性肽段進(jìn)行定量,。其適用范圍主要包括以下幾類研究：

1、小分子內(nèi)源肽段差異表達(dá)分析

如神經(jīng)肽,、激素肽,、免疫相關(guān)調(diào)節(jié)肽等，這些天然存在的短肽可被直接標(biāo)記,，比較不同處理組下的表達(dá)變化,。

2、富集肽段組分的定量研究

通過分子量截留、磁珠富集等方法預(yù)處理后獲取的肽段混合物,，更適合iTRAQ標(biāo)簽標(biāo)記和定量,，尤其在液體活檢中常見。

3,、藥物干預(yù),、疾病模型中肽段響應(yīng)分析

例如研究藥物誘導(dǎo)下肽段水平變化，評估肽段是否可能為藥物作用靶點(diǎn)或下游應(yīng)答產(chǎn)物,。

四,、iTRAQ標(biāo)簽技術(shù)在肽組學(xué)分析中的優(yōu)勢與局限

1、優(yōu)勢

（1）定量jīngquè：不同樣本數(shù)據(jù)直接來自同一次質(zhì)譜掃描,，避免批次誤差

（2）通量高：一次實驗支持多組樣本,，節(jié)省成本與時間

（3）可聯(lián)合蛋白組數(shù)據(jù)：方便與傳統(tǒng)iTRAQ蛋白組數(shù)據(jù)進(jìn)行整合分析，構(gòu)建“蛋白-肽段”調(diào)控圖譜

（4）適用于液體樣本：如血清,、尿液,、腦脊液中的內(nèi)源肽段分析，適配性強(qiáng)

2,、局限

（1）對極短肽段適用性較差：肽段過短或缺乏標(biāo)記位點(diǎn)（如N末端氨基或賴氨酸）會影響標(biāo)簽接入

（2）標(biāo)記效率要求高：若標(biāo)記不wánquán會干擾定量準(zhǔn)確性

（3）不適用于全HLA肽組學(xué)：因HLA肽段需保持原始結(jié)構(gòu),，iTRAQ標(biāo)記有可能改變其構(gòu)象或影響親和驗證

在需要多組樣本平行定量、研究內(nèi)源肽段表達(dá)差異的場景中,，iTRAQ標(biāo)簽技術(shù)依然具備重要價值,。通過合理設(shè)計實驗流程和優(yōu)化前處理策略，iTRAQ可以成為肽組學(xué)分析中有力的“定量引擎”,。百泰派克生物科技將持續(xù)完善質(zhì)譜平臺與標(biāo)簽策略,，為科研人員提供可靠、高效,、jīngzhǔn的肽組學(xué)定量解決方案,，助力更深入的生物標(biāo)志物發(fā)現(xiàn)與機(jī)制探索。

百泰派克生物科技特色項目

一,、蛋白測序

百泰派克生物科技使用Thermo公司新推出的Obitrap Fusion Lumos質(zhì)譜儀及島津公司埃德曼降解測序系統(tǒng)對dànbáizhì序列進(jìn)行分析,，提供基于質(zhì)譜的蛋白測序分析服務(wù)，包括對dànbáizhì的氨基酸組成分析,，Nduāncèxù,，Cduāncèxù和全序列分析，以及基于埃德曼降解的dànbáizhìN端序列分析服務(wù),。對于未知理論序列的dànbáizhì,，提供基于從頭測序法的dànbáizhì從頭測序服務(wù)，對蛋白序列進(jìn)行分析,。

※服務(wù)優(yōu)勢：

1.采用目前世界上*的質(zhì)譜儀器 Obitrap Fusion Lumos;

2.可實現(xiàn)對所測定靶蛋白序列 100% 的覆蓋;

3.可測定蛋白N端多達(dá) 70個氨基酸序列;

4.可測定多種形式的樣品: 蛋白溶液,、PVDF 蛋白條帶;

5.樣品用量低: 蛋白樣品僅需 5-10ug，即可完成檢測;

6.測序不受N端封閉,，PEC和和糖基化等N端修飾的影響,。

二、dànbáizhì組學(xué)

百泰派克生物科技采用Thermo Fisher的Orbitrap Fusion Lumos質(zhì)譜平臺結(jié)合Nano-LC,，提供定量dànbáizhì組學(xué),、靶向dànbáizhì組學(xué)、多肽組學(xué),、翻譯后修飾蛋白組學(xué)等多種dànbáizhì組學(xué)分析服務(wù),。此外，百泰派克生物科技新推出基于timsTOF Pro的4Ddànbáizhì組學(xué)服務(wù),，助力微量樣本蛋白組學(xué),、大樣本群醫(yī)學(xué)及高通量修飾組學(xué)等研究工作。

※服務(wù)優(yōu)勢：

1 .高通量定量蛋白分析:多對照組大規(guī)模實驗分析,，發(fā)現(xiàn)新的生物標(biāo)記物;

2.體內(nèi)體外多種dànbáizhì標(biāo)記方法,，適用于分析組織、細(xì)胞,、血液等多種樣品;

3.質(zhì)譜分析靈敏度高,，實驗結(jié)果重復(fù)度高;

4.可檢測較低豐度蛋白，線性范圍廣;

5.zhuānyè生物信息學(xué)分析,，分析更系統(tǒng)準(zhǔn)確,。

三、單細(xì)胞質(zhì)譜流式技術(shù)分析

百泰派克生物科技采用Fluidigm質(zhì)譜流式系統(tǒng)進(jìn)行單細(xì)胞質(zhì)譜流式技術(shù)分析,，采用金屬元素標(biāo)記物（通常是金屬元素標(biāo)記的特異抗體）標(biāo)記細(xì)胞表面和內(nèi)部的分子,，然后用流式細(xì)胞原理分離單個細(xì)胞，再用電感耦合等離子體質(zhì)譜（ICP-MS）分析單個細(xì)胞的原子質(zhì)量譜,，zuì后將原子質(zhì)量譜數(shù)據(jù)轉(zhuǎn)換為細(xì)胞表面和內(nèi)部的信號分子表達(dá)量,。

※服務(wù)優(yōu)勢：

1.技術(shù)*，*技術(shù)空白

采用金屬標(biāo)記抗體技術(shù),，避免了傳統(tǒng)流式熒光通道少且易相互影響的問題,。可在單細(xì)胞層面上對多種指標(biāo)同時進(jìn)行表征,，百泰派克生物科技可做到同時檢測51個目標(biāo)蛋白,。

2.分析數(shù)量大，成本較低

單細(xì)胞RNAseq受成本等因素限制,，所有樣本細(xì)胞匯總的分析數(shù)目一般在2x10^4個左右,，而流式質(zhì)譜技術(shù)一次（單樣本）就可分析至少10^5的細(xì)胞，實現(xiàn)了數(shù)量級的提高,，且成本不高于單細(xì)胞RNAseq,。

3.應(yīng)用前景大

①流式質(zhì)譜結(jié)果可以給出細(xì)胞亞群的變化,，在臨床診斷、疾病機(jī)制研究等方面具有極大的研究前景,；

②將金屬標(biāo)簽技術(shù)與其他技術(shù)結(jié)合會有新應(yīng)用方向,。除常規(guī)蛋白外，質(zhì)譜流式細(xì)胞技術(shù)還可用于蛋白翻譯后修飾,；

③可檢測細(xì)胞存活率,、細(xì)胞大小、mRNA轉(zhuǎn)錄子表達(dá)量,、DNA合成速率以及蛋白酶活性等,。

四、基于高精度質(zhì)譜的免疫多肽組學(xué)分析及新抗原發(fā)現(xiàn)

百泰派克生物科技的基于高精度質(zhì)譜的免疫多肽組學(xué)分析及新抗原發(fā)現(xiàn)一站式解決方案包括我們專有的,、高度敏感的免疫肽富集和鑒定方案,。我們能夠幫助您實現(xiàn)10,000個以上I型多肽和10,000個以上II型多肽的鑒定和識別。通過我們優(yōu)化的高通量免疫多肽組學(xué)分析平臺進(jìn)行免疫肽組學(xué)分析,，可從zuì小的樣品材料中進(jìn)行可重復(fù)的識別和定量,。該服務(wù)可以應(yīng)用于大規(guī)模的研究，旨在助力科研工作者尋找癌癥,、免疫疾病及傳染病的解決方案,，深入挖掘未知的靶標(biāo)。

五,、生物藥物表征

百泰派克基于高分辨率質(zhì)譜技術(shù),，MALDI TOF，高效色譜分離技術(shù),，提供一系列完善的生物藥物分析方案,，從dànbáizhì、多肽,、抗體,、疫苗等生物制品的氨基酸組成和一級結(jié)構(gòu)分析，到產(chǎn)品變異性和純度分析,。旨在提供優(yōu)質(zhì)生物藥物分析服務(wù),，幫助生物醫(yī)藥生產(chǎn)商提高生物藥物品質(zhì)。

百泰派克生物科技七大檢測平臺

百泰派克生物科技-生物制品表征,，生物質(zhì)譜多組學(xué)優(yōu)質(zhì)服務(wù)商

北京百泰派克生物科技有限公司致力于為生物/制藥和醫(yī)療器械行業(yè)提供質(zhì)量控制檢測和項目驗證等zhuānyè服務(wù)。公司實驗室遵循NMPA,、ICH,、FDA和EMA等的法規(guī)和指導(dǎo)原則，通過CNAS/ISO9001雙重質(zhì)量體系認(rèn)證,，建立了完備的質(zhì)量體系,，數(shù)據(jù)冷熱/異地備份,，設(shè)備定期計量/期間核查，軟件審計追蹤,，為客戶提供一體化解決方案和技術(shù)服務(wù),，支持新藥研發(fā)、藥物申報注冊和生產(chǎn)放行,。

1.公司采用ISO9001質(zhì)量控制體系,，zhuānyè提供以質(zhì)譜為基礎(chǔ)的CRO檢測分析服務(wù),；

2.獲國家CNAS實驗室認(rèn)可,，為客戶提供符合全球藥政法規(guī)的藥物質(zhì)量研究服務(wù)；

3.業(yè)務(wù)范圍覆蓋dànbáizhì組學(xué),、多肽組學(xué),、代謝組學(xué)、生物藥物表征,、單細(xì)胞分析,、單細(xì)胞質(zhì)譜流式、生信云分析以及多組學(xué)生物質(zhì)譜整合分析等,；

4.七大質(zhì)量控制檢測平臺,，滿足您一站式服務(wù)需求；

5.服務(wù)3000+企業(yè),，10000+客戶的選擇,；

6.致力于為您提供優(yōu)質(zhì)的生物質(zhì)譜分析服務(wù)!

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