如何利用CD分析蛋白質熱穩(wěn)定性檢測技術服務詳情介紹

dànbáizhì熱穩(wěn)定性是衡量其結構完整性與功能保持能力的關鍵指標,，廣泛應用于基礎研究、蛋白工程和生物藥開發(fā)等多個領域,。圓二色譜（Circular Dichroism, CD）是一種敏感,、快速且低樣本量的光譜技術，常用于分析dànbáizhì二級結構的構象變化,，特別適合評估熱變性行為和熔點（Tm）等熱穩(wěn)定性參數,。

一、CD技術在dànbáizhì熱穩(wěn)定性分析中的作用

圓二色譜是依賴手性分子對左右旋圓偏振光吸收差異的光譜技術,。對于dànbáizhì而言,，其二級結構（如α-螺旋、β-折疊）會在190–250nm的遠紫外區(qū)域產生特征性CD信號,。例如,，α-螺旋通常在208nm與222nm附近顯示雙重負峰，而β-折疊結構在216nm左右表現為負峰,。當溫度升高導致dànbáizhì發(fā)生熱變性時,，其原有的有序結構被破壞,，CD光譜的特征信號會發(fā)生顯著變化,。因此，通過監(jiān)測不同溫度下蛋白的CD信號,，尤其是222nm處橢圓率值的變化,，可jīngquè描繪蛋白熱解構過程，進一步計算熔點Tm值,，反映其熱穩(wěn)定性,。

二、實驗設計與操作關鍵點

為獲得可靠的CD熱變性數據,，實驗設計需要充分考慮樣品特性,、緩沖體系,、波長選擇與升溫條件等多重因素。

1,、蛋白樣品制備

樣品純度和均一性對實驗結果至關重要,。推薦使用純度＞90%的dànbáizhì，避免聚集體或多態(tài)性干擾,。緩沖液應具備良好的熱穩(wěn)定性和低紫外吸收,，常用如PBS、HEPES等,，避免使用Tris等溫度敏感緩沖液,。蛋白濃度一般控制在0.1–0.5mg/mL，確保獲得良好的信噪比,。

2,、波長選擇

熱變性實驗通常選擇222nm作為主要監(jiān)測波長，因其對α-螺旋結構變化zuì敏感,。對β-折疊結構豐富的蛋白,，也可關注216nm波長處的變化。完整的遠紫外CD光譜（190–250nm）可用于變性前后結構比較,，輔助判斷變性過程的方向與程度,。

3、溫度范圍與升溫速率

溫度通常從10°C起,，逐漸升高至90–95°C,，具體依據dànbáizhì的預期穩(wěn)定性設定。升溫速率建議控制在0.5–1°C/min,，保證系統(tǒng)熱平衡,，避免數據偏差。每隔1–2°C記錄一個數據點,，可描繪出平滑的溫度-橢圓率曲線,。

4、可逆性測試

在部分研究場景中,，評估蛋白變性過程是否可逆具有重要意義,。可在完成升溫掃描后,，將樣品緩慢冷卻至初始溫度,，再重新采集CD光譜，與加熱前光譜比較,。若結構能夠恢復,，說明變性過程具有一定可逆性，適用于構象可恢復的天然蛋白或某些工程蛋白設計的評價。

三,、數據解讀與Tm計算方法

CD熱變性實驗的結果通常表現為典型的S型曲線：初始階段蛋白結構穩(wěn)定,，橢圓率信號保持恒定；隨著溫度升高,，蛋白逐步解構,，橢圓率急劇下降；zuì終趨于平臺,，代表wánquán變性狀態(tài),。

Tm值提取

Tm值是熱穩(wěn)定性分析的核心參數，表示dànbáizhì失去一半有序結構的溫度,。常采用雙態(tài)轉變模型（two-state transition model）對熱變性曲線進行非線性擬合,，假設蛋白在“天然態(tài)”與“變性態(tài)”之間直接轉化。通過擬合可準確獲得Tm值及協同性參數,，量化熱變性過程,。對于多結構域或多穩(wěn)定態(tài)蛋白，變性過程可能涉及多個Tm,，需根據曲線形態(tài)與波峰/拐點位置綜合判斷,，或輔以多波長分析提高解析能力。

四,、實驗中常見問題及優(yōu)化建議

1,、信號波動或曲線不連續(xù)

可能由緩沖液干擾、蛋白聚集或氣泡引起,。應確保緩沖液經脫氣處理,、使用匹配的石英比色皿，并在樣品制備后短時間內完成實驗,。

2,、Tm值重復性差

需檢查升溫系統(tǒng)穩(wěn)定性、樣品是否降解或緩沖系統(tǒng)是否失效,。建議每個樣品重復測試至少3次,，確認Tm值具有統(tǒng)計意義。

3,、解構不wánquán或無明顯轉變

可能是dànbáizhì極度穩(wěn)定,，Tm超出檢測上限；也可能蛋白本身構象柔性高,，熱誘導不顯著,。此時可嘗試延長升溫范圍,、調節(jié)緩沖環(huán)境,，或考慮聯合化學變性策略如尿素誘導。

圓二色譜技術作為dànbáizhì熱穩(wěn)定性研究的重要工具，因其對二級結構敏感,、操作簡便,、樣品消耗低等特點，已廣泛應用于天然dànbáizhì,、重組蛋白及突變體構象穩(wěn)定性的評估,。通過優(yōu)化實驗條件與數據分析方法，科研人員可快速,、jīngzhǔn地獲取Tm等關鍵參數,，從而為dànbáizhì功能機制解析、工程優(yōu)化與藥物研發(fā)提供強有力的數據支持,。在CD分析及蛋白穩(wěn)定性研究領域,，百泰派克生物科技憑借先進的儀器平臺和規(guī)范化實驗流程，致力于為科研人員提供高質量的dànbáizhì圓二色譜分析服務,，助力您揭示蛋白構象背后的生物學意義,。

百泰派克生物科技特色項目

一、蛋白測序

百泰派克生物科技使用Thermo公司新推出的Obitrap Fusion Lumos質譜儀及島津公司埃德曼降解測序系統(tǒng)對dànbáizhì序列進行分析,，提供基于質譜的蛋白測序分析服務,，包括對dànbáizhì的氨基酸組成分析，Nduāncèxù,，Cduāncèxù和全序列分析,，以及基于埃德曼降解的dànbáizhìN端序列分析服務。對于未知理論序列的dànbáizhì,，提供基于從頭測序法的dànbáizhì從頭測序服務,，對蛋白序列進行分析。

※服務優(yōu)勢：

1.采用目前世界上先進的質譜儀器 Obitrap Fusion Lumos;

2.可實現對所測定靶蛋白序列 100% 的覆蓋;

3.可測定蛋白N端多達 70個氨基酸序列;

4.可測定多種形式的樣品: 蛋白溶液,、PVDF 蛋白條帶;

5.樣品用量低: 蛋白樣品僅需 5-10ug,，即可完成檢測;

6.測序不受N端封閉，PEC和和糖基化等N端修飾的影響,。

二,、dànbáizhì組學

百泰派克生物科技采用Thermo Fisher的Orbitrap Fusion Lumos質譜平臺結合Nano-LC，提供定量dànbáizhì組學,、靶向dànbáizhì組學,、多肽組學、翻譯后修飾蛋白組學等多種dànbáizhì組學分析服務,。此外,，百泰派克生物科技新推出基于timsTOF Pro的4Ddànbáizhì組學服務，助力微量樣本蛋白組學,、大樣本群醫(yī)學及高通量修飾組學等研究工作,。

※服務優(yōu)勢：

1 .高通量定量蛋白分析:多對照組大規(guī)模實驗分析,，發(fā)現新的生物標記物;

2.體內體外多種dànbáizhì標記方法，適用于分析組織,、細胞,、血液等多種樣品;

3.質譜分析靈敏度高，實驗結果重復度高;

4.可檢測較低豐度蛋白,，線性范圍廣;

5.zhuānyè生物信息學分析,，分析更系統(tǒng)準確。

三,、單細胞質譜流式技術分析

百泰派克生物科技采用Fluidigm質譜流式系統(tǒng)進行單細胞質譜流式技術分析,，采用金屬元素標記物（通常是金屬元素標記的特異抗體）標記細胞表面和內部的分子，然后用流式細胞原理分離單個細胞,，再用電感耦合等離子體質譜（ICP-MS）分析單個細胞的原子質量譜,，zuì后將原子質量譜數據轉換為細胞表面和內部的信號分子表達量。

※服務優(yōu)勢：

1.技術先進,，填補技術空白

采用金屬標記抗體技術,，避免了傳統(tǒng)流式熒光通道少且易相互影響的問題?？稍趩渭毎麑用嫔蠈Χ喾N指標同時進行表征,，百泰派克生物科技可做到同時檢測51個目標蛋白。

2.分析數量大,，成本較低

單細胞RNAseq受成本等因素限制,，所有樣本細胞匯總的分析數目一般在2x10^4個左右，而流式質譜技術一次（單樣本）就可分析至少10^5的細胞,，實現了數量級的提高,，且成本不高于單細胞RNAseq。

3.應用前景大

①流式質譜結果可以給出細胞亞群的變化,，在臨床診斷,、疾病機制研究等方面具有極大的研究前景；

②將金屬標簽技術與其他技術結合會有新應用方向,。除常規(guī)蛋白外,，質譜流式細胞技術還可用于蛋白翻譯后修飾；

③可檢測細胞存活率,、細胞大小,、mRNA轉錄子表達量、DNA合成速率以及蛋白酶活性等,。

四,、基于高精度質譜的免疫多肽組學分析及新抗原發(fā)現

百泰派克生物科技的基于高精度質譜的免疫多肽組學分析及新抗原發(fā)現一站式解決方案包括我們專有的、高度敏感的免疫肽富集和鑒定方案,。我們能夠幫助您實現10,000個以上I型多肽和10,000個以上II型多肽的鑒定和識別,。通過我們優(yōu)化的高通量免疫多肽組學分析平臺進行免疫肽組學分析,，可從zuì小的樣品材料中進行可重復的識別和定量。該服務可以應用于大規(guī)模的研究,，旨在助力科研工作者尋找癌癥、免疫疾病及傳染病的解決方案,，深入挖掘未知的靶標,。

五、生物藥物表征

百泰派克基于高分辨率質譜技術,，MALDI TOF,，高效色譜分離技術，提供一系列完善的生物藥物分析方案,，從dànbáizhì,、多肽、抗體,、疫苗等生物制品的氨基酸組成和一級結構分析,，到產品變異性和純度分析。旨在提供優(yōu)質生物藥物分析服務,，幫助生物醫(yī)藥生產商提高生物藥物品質,。

百泰派克生物科技七大檢測平臺

百泰派克生物科技-生物制品表征，生物質譜多組學優(yōu)質服務商

北京百泰派克生物科技有限公司致力于為生物/制藥和醫(yī)療器械行業(yè)提供質量控制檢測和項目驗證等zhuānyè服務,。公司實驗室遵循NMPA、ICH,、FDA和EMA等的法規(guī)和指導原則,，通過CNAS/ISO9001雙重質量體系認證，建立了完備的質量體系,，數據冷熱/異地備份,，設備定期計量/期間核查，軟件審計追蹤,，為客戶提供一體化解決方案和技術服務,，支持新藥研發(fā)、藥物申報注冊和生產放行,。

1.公司采用ISO9001質量控制體系,，zhuānyè提供以質譜為基礎的CRO檢測分析服務；

2.獲國家CNAS實驗室認可,，為客戶提供符合全球藥政法規(guī)的藥物質量研究服務,；

3.業(yè)務范圍覆蓋dànbáizhì組學、多肽組學,、代謝組學,、生物藥物表征,、單細胞分析、單細胞質譜流式,、生信云分析以及多組學生物質譜整合分析等,；

4.七大質量控制檢測平臺，滿足您一站式服務需求,；

5.服務3000+企業(yè),，10000+客戶的選擇；

6.致力于為您提供優(yōu)質的生物質譜分析服務!

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