細(xì)胞色素b5（Cytochrome b5）含量測(cè)定試劑盒說書

微量法 100T/96S

正式測(cè)定前務(wù)必取 2-3 個(gè)預(yù)期差異較大的樣本做預(yù)測(cè)定測(cè)定意義：

細(xì)胞色素P450 酶是一組主要存在于肝臟的同工酶,，在外源物質(zhì)代謝中具有重要作用,，尤其是藥物和毒物的代謝。細(xì)胞色素 P450 和細(xì)胞色素b5 是P450 酶系的兩個(gè)血紅素蛋白,，其比值的變化與 P450 代謝活性密切相關(guān),。

測(cè)定原理：

氧化型細(xì)胞色素 b5 經(jīng)連二亞硫酸鈉還原后，在 424nm 處有最大吸收峰,，通過測(cè)定 424nm 和 490nm 處吸光值的差異,，即可計(jì)算出細(xì)胞色素b5 的含量。

細(xì)胞色素b5含量測(cè)定試劑盒   P450系列

組成：

試劑一：粉劑×2 瓶,，4℃保存,。臨用前各加 100ml 蒸餾水，充分溶解,。

工作液配制：

臨用前配制,，戴一次性手套，小心打開試劑三瓶蓋,，加試劑二 20ml 充分溶解,，4℃避光可保存 1 周。

具體產(chǎn)品的參數(shù)以收到產(chǎn)品說明書的參數(shù)為準(zhǔn)

自備儀器和用品：

普通離心機(jī),，超速離心機(jī),、可調(diào)式移液槍、紫外分光光度計(jì)/酶標(biāo)儀、微量玻璃比色皿/96 孔板,、和蒸餾水,。

樣品中細(xì)胞色素 b5 提取：

1、除去細(xì)胞核,，線粒體等大分子物質(zhì)：稱約 0.5g 組織,，加入 1ml 試劑一，冰上充分研磨,，10 000g 4℃離心 30min,，取上清液，轉(zhuǎn)入超速離心管中,。

2,、粗制微粒體：100 000g，4℃離心 60min,，棄上清液,。

3、除血紅蛋白等雜質(zhì)：向步驟 2 的沉淀中加 1ml 試劑一,，蓋緊后充分震蕩溶解,，100 000g 離心 30min,，棄上清液。

4,、待測(cè)液：向步驟 3 的沉淀中加試劑二 0.5ml,，蓋緊后充分震蕩溶解，即待測(cè)液,，該待測(cè)液需當(dāng)天測(cè)定,。

細(xì)胞色素 b5 含量測(cè)定操作：

1. 分光光度計(jì)/酶標(biāo)儀預(yù)熱 30 min。

2. 工作液置于 25℃水浴中預(yù)熱 30 min,。

3. 空白管：取 1ml 玻璃比色皿,，加入 10 μl 蒸餾水，200μl 工作液,，室溫靜置 2 min,，424nm 和 490nm 處吸光值，424nm 處吸光值記為A 空白管 1,，490nm 處吸光值記為A 空白管 2,。△A 空白管= A 空白管 1- A 空白管 2

4. 測(cè)定管：取 1ml 玻璃比色皿，加入 10 μl 待測(cè)液,，200μl 工作液,，室溫靜置 2 min,，424nm 和 490nm 處吸光值，424nm 處吸光值記為A 測(cè)定管 1,，490nm 處吸光值記為A 測(cè)定管 2。

△A 測(cè)定管= A 測(cè)定管 1- A 測(cè)定管 2,。

注意：只需要做一個(gè)空白管,。

樣品細(xì)胞色素 b5 含量計(jì)算公式：

a. 使用微量石英比色皿測(cè)定的計(jì)算公式如下

（1） 按蛋白濃度計(jì)算

細(xì)胞色素b5 含量(nmol/mg prot) = (△A 測(cè)定管-△A 空白管)÷(ε×d)×V 反總÷（Cpr×V 樣）

= 122.8×(△A 測(cè)定管-△A 空白管)÷Cpr

（2） 按樣本質(zhì)量計(jì)算

細(xì)胞色素b5 含量（nmol/g 鮮重）= (△A 測(cè)定管-△A 空白管)÷(ε×d)×V 反總×（V 樣總÷V 樣）÷W

= 61.4×(△A 測(cè)定管-△A 空白管)÷W

ε：還原型細(xì)胞色素b5 納摩爾消光系數(shù)，171×10^-6 L/nmol/cm,；d：比色皿光徑（cm）,，1cm； V 反總：反應(yīng)體系總體積,，210 μl =2.1×10^-4 L,；Cpr：待測(cè)液蛋白質(zhì)濃度（mg/ml），需要另外測(cè)定,；V 樣：加入反應(yīng)體系中待測(cè)液體積,，10 μl=0.01 ml；V 樣總：待測(cè)液總體積,，0.5 ml,；W：樣品質(zhì)量（g）。

b. 使用 96 孔板測(cè)定的計(jì)算公式如下

（1） 按蛋白濃度計(jì)算

細(xì)胞色素b5 含量(nmol/mg prot) = (△A 測(cè)定管-△A 空白管)÷(ε×d)×V 反總÷（Cpr×V 樣）

= 245.6×(△A 測(cè)定管-△A 空白管)÷Cpr

（2） 按樣本質(zhì)量計(jì)算

細(xì)胞色素b5 含量（nmol/g 鮮重）= (△A 測(cè)定管-△A 空白管)÷(ε×d)×V 反總×（V 樣總÷V 樣）÷W

= 122.8×(△A 測(cè)定管-△A 空白管)÷W

ε：還原型細(xì)胞色素b5 納摩爾消光系數(shù),，171×10^-6 L/nmol/cm,；d：96 孔板光徑（cm），0.5cm,； V 反總：反應(yīng)體系總體積,，210 μl =2.1×10^-4 L；Cpr：待測(cè)液蛋白質(zhì)濃度（mg/ml）,，需要另外測(cè)定,；V 樣：加入反應(yīng)體系中待測(cè)液體積,，10 μl=0.01 ml,；V 樣總：待測(cè)液總體積，0.5 ml,；W：樣品質(zhì)量（g）,。

細(xì)胞色素b5含量測(cè)定試劑盒   P450系列