苯胺-4-羥化酶（AH）活性測定試劑盒說明書

微量法 100 管/48 樣

正式測定前務(wù)必取 2-3 個預(yù)期差異較大的樣本做預(yù)測定測定意義：

細(xì)胞色素P450 酶是一組主要存在于肝臟的同工酶，在外源物質(zhì)代謝中具有重要作用,，尤其是藥物和毒物的代謝。AH 在P450 酶系中相當(dāng)于CYP2E1 亞型，CYP2E1 不僅參與了藥物的代謝,，而且還能催化多種前致癌物和前毒物的活化過程。

測定原理：

AH 催化苯胺羥化后產(chǎn)生的 4-氨基酚,，進(jìn)一步轉(zhuǎn)變?yōu)榉?/span>-吲哚復(fù)合物，在 630nm 處有特征吸收峰,；通過測定 630nm 吸光度增加速率,，來計算AH 活性。

苯胺-4-羥化酶（AH）活性測定試劑盒

組成：

試劑一：粉劑×1 瓶,，4℃保存,。臨用前加入 100ml 蒸餾水，充分溶解,。試劑三：粉劑×1 瓶,，4℃保存。臨用前加入 10ml 蒸餾水,，充分溶解,。試劑四：粉劑×1 瓶，4℃保存,。臨用前加入 5ml 蒸餾水,，充分溶解。

試劑六：粉劑×1 瓶（腐蝕性試劑）,，4℃避光保存,。臨用前加入 10ml 蒸餾水，充分溶解,。試劑七：粉劑×1 瓶,，4℃保存。臨用前加入 10ml 蒸餾水充分溶解,。

標(biāo)準(zhǔn)液：液體×1 瓶,，10μmol/L，4℃避光保存,。

具體產(chǎn)品的參數(shù)以收到產(chǎn)品說明書的參數(shù)為準(zhǔn)

自備儀器和用品：

普通離心機,、超速離心機、可見分光光度計/酶標(biāo)儀,、微量玻璃比色皿/96 孔板,、雙蒸水和冰。

粗酶液提?。?/span>

1,、除去細(xì)胞核，線粒體等大分子物質(zhì)：稱約 0.5g 組織,，加入 1ml 試劑一,，冰上充分研磨，10 000g 4℃,，離心 30min,，取上清液,，轉(zhuǎn)移到超速離心管中。

2,、粗制微粒體： 100 000g 4℃,，離心 60min，棄上清液,。

3,、除血紅蛋白等雜質(zhì)：向步驟 2 的沉淀中加 1ml 試劑一，蓋緊后充分震蕩溶解,，100 000g 離心 30min,，棄

上清液。

4,、最終微粒體：向步驟 3 的沉淀中加試劑二 0.5ml,，蓋緊后充分震蕩溶解，即粗酶液,，待測,。

測定操作：

1. 分光光度計/酶標(biāo)儀預(yù)熱 30 min，調(diào)節(jié)波長到 630 nm,，蒸餾水調(diào)零,。

2. 試劑三置于 37℃水浴中預(yù)熱 30min。

3. 試劑五置于冰浴預(yù)冷 30min,。

4. 標(biāo)準(zhǔn)管：取 0.5 ml EP 管,，加入 100μl 標(biāo)準(zhǔn)液，100μl 試劑六,，100μl 試劑七,，混勻后室溫靜置 30min，吸取 200μl 于微量玻璃比色皿/96 孔板,，630 nm 測定光吸收,，記為A 標(biāo)準(zhǔn)管。

5. 對照管：取 0.5 ml EP 管,，加入 50μl 粗酶液,，100μl 試劑三，50μl 蒸餾水,，混勻后 37℃水浴中保溫 30min,；

再加入 100μl 試劑五,，混勻后冰浴 5min,，11000rpm，4℃,，離心 10min,；取 100μl 上清液,，加入新的 0.5 ml EP 管；再加入 100μl 試劑六,，100μl 試劑七,，混勻后室溫靜置 30min，吸取 200μl 于微量玻璃比色皿/96 孔板,，630 nm 測定光吸收,，記為 A 對照管。

6. 測定管：取 0.5 ml EP 管,，加入 50μl 粗酶液,，100μl 試劑三，50μl 試劑四,，混勻后 37℃水浴中保溫 30min,；

再加入 100μl 試劑五，混勻后冰浴 5min,，11000rpm,，4℃，離心 10min,；取 100μl 上清液,，加入新的 0.5 ml EP 管；再加入 100μl 試劑六,，100μl 試劑七,，混勻后室溫靜置 30min，吸取 200μl 于微量玻璃比色皿/96 孔板,，630 nm 測定光吸收,，記為 A 測定管。

AH 活性計算公式：

a. 使用微量石英比色皿測定的計算公式如下

（1） 按蛋白濃度計算

活性單位定義：37℃中每毫克蛋白每分鐘催化產(chǎn)生 1nmol 4-氨基酚為 1 個酶活單位,。

AH 活性(nmol/min/mg prot) = C 標(biāo)準(zhǔn)品×V 標(biāo)準(zhǔn)品×（A 測定管－A 對照管）÷A 標(biāo)準(zhǔn)管×稀釋倍數(shù)÷（Cpr×V樣）÷T

= 2×（A 測定管－A 對照管）÷A 標(biāo)準(zhǔn)管÷Cpr,。

（2） 按樣本質(zhì)量計算

活性單位定義：37℃中每克樣本每分鐘催化產(chǎn)生 1nmol 4-氨基酚為 1 個酶活單位。

AH 活性(nmol/min/g 鮮重)= C 標(biāo)準(zhǔn)品×V 標(biāo)準(zhǔn)品×（A 測定管－A 對照管）÷A 標(biāo)準(zhǔn)管×稀釋倍數(shù)÷(W×V 樣)÷T

= 2×（A 測定管－A 對照管）÷A 標(biāo)準(zhǔn)管÷W

C 標(biāo)準(zhǔn)品：10μmol/L,；V 標(biāo)準(zhǔn)品：100μl=1×10^-4L,；稀釋倍數(shù)： V 反總÷V 上清液=300μl÷100μl=3；Cpr：粗酶液蛋白質(zhì)濃度（mg/ml）,，需要另外測定,，建議使用本公司 BCA 蛋白質(zhì)含量測定試劑盒；W ：樣品質(zhì)量,；V 樣：加入反應(yīng)體系中粗酶液體積,， 50μl=0.05 ml； T：催化反應(yīng)時間（min），30min,。

b. 使用 96 孔板測定的計算公式如下

（1） 按蛋白濃度計算

活性單位定義：37℃中每毫克蛋白每分鐘催化產(chǎn)生 1nmol 4-氨基酚為 1 個酶活單位,。

AH 活性(nmol/min/mg prot) = C 標(biāo)準(zhǔn)品×V 標(biāo)準(zhǔn)品×（A 測定管－A 對照管）÷A 標(biāo)準(zhǔn)管×稀釋倍數(shù)÷（Cpr×V樣）÷T

= 2×（A 測定管－A 對照管）÷A 標(biāo)準(zhǔn)管÷Cpr

（2） 按樣本質(zhì)量計算

活性單位定義：37℃中每克樣本每分鐘催化產(chǎn)生 1nmol 4-氨基酚為 1 個酶活單位。

AH 活性(nmol/min/g 鮮重) = C 標(biāo)準(zhǔn)品×V 標(biāo)準(zhǔn)品×（A 測定管－A 對照管）÷A 標(biāo)準(zhǔn)管×稀釋倍數(shù)÷(W×V 樣)÷T

= 2×（A 測定管－A 對照管）÷A 標(biāo)準(zhǔn)管÷W

C 標(biāo)準(zhǔn)品：10μmol/L,；V 標(biāo)準(zhǔn)品：100μl=1×10^-4L,；稀釋倍數(shù)：V 反總÷V 上清液=300μl÷100μl=3；Cpr：粗酶液蛋白質(zhì)濃度（mg/ml）,，需要另外測定,，建議使用本公司 BCA 蛋白質(zhì)含量測定試劑盒； W ：樣品質(zhì)量,； V 樣：加入反應(yīng)體系中粗酶液體積,， 50μl=0.05 ml； T：催化反應(yīng)時間（min）,，30min,。

苯胺-4-羥化酶（AH）活性測定試劑盒