氨基bi林-N-脫甲基酶（AND）活性測(cè)定試劑盒說(shuō)明書(shū)

微量法 100 管/48 樣

正式測(cè)定前務(wù)必取 2-3 個(gè)預(yù)期差異較大的樣本做預(yù)測(cè)定測(cè)定意義：

細(xì)胞色素P450 酶是一組在外源物質(zhì)代謝中,，尤其是藥物和毒物,，具有重要作用的酶系。AND 作為P450酶系的重要一員,，相當(dāng)于CYP3A4 亞型,，與藥物的去甲基化反應(yīng)密切相關(guān)。

測(cè)定原理：

AND 催化氨基bi林釋放甲醛,，通過(guò) Nash 比色法測(cè)定甲醛含量,，即可計(jì)算出 AND 活性。

氨基bi林-N-脫甲基酶活性測(cè)定試劑盒   P450

組成：

試劑一：粉劑×1 瓶,，4℃保存,。臨用前加 100ml 蒸餾水充分溶解。

試劑三：粉劑×1 管,，4℃避光保存,。臨用前加入 1ml 無(wú)水乙醇，充分溶解,。試劑四：粉劑×1 管,，4℃保存。臨用前加入 0.5ml 蒸餾水,，充分溶解,。

試劑五：粉劑×1 瓶，室溫保存,。臨用前加蒸餾水 4ml 充分溶解,。

標(biāo)準(zhǔn)液：液體×1 瓶，-20℃保存,。臨用前取 1.5ml EP 管,，加入 10μl 標(biāo)準(zhǔn)液，加 990μl 蒸餾水,，混勻即為0.05 mmol/L 標(biāo)準(zhǔn)jia醛溶液,，4℃保存,。

具體產(chǎn)品的參數(shù)以收到產(chǎn)品說(shuō)明書(shū)的參數(shù)為準(zhǔn)

自備儀器和用品：

普通離心機(jī),，超速離心機(jī),、水浴鍋、可調(diào)式移液槍,、紫外分光光度計(jì)/酶標(biāo)儀,、微量石英比色皿/96 孔板、蒸餾水,、無(wú)水乙醇和冰,。

粗酶液提取：

1,、除去細(xì)胞核,，線粒體等大分子物質(zhì)：稱約 0.5g 組織,，加入 1 ml 試劑一,，冰上充分研磨,，10 000g 4℃離心 30min,，取上清液轉(zhuǎn)入超速離心管,。

2,、粗制微粒體：4℃,，100 000g,，離心 60min，棄上清液,。

3,、除血紅蛋白等雜質(zhì)：向步驟 2 的沉淀中加 1ml 試劑一，蓋緊后充分震蕩溶解,，100 000g 離心 30min,，棄上清液。

4,、最終微粒體：向步驟 3 的沉淀中加試劑二 0.5 ml,，蓋緊后充分震蕩溶解，即粗酶液,，待測(cè),。該待測(cè)液需

當(dāng)天使用。

AND 活性測(cè)定操作：

1. 分光光度計(jì)/酶標(biāo)儀預(yù)熱 30 min,，調(diào)節(jié)波長(zhǎng)到 412 nm,，蒸餾水調(diào)零。

2. 試劑二置于 37℃水浴中預(yù)熱 30min,。

3. 對(duì)照管：取 1 支EP 管,，加入 10μl 粗酶液，170μl 試劑二,，10μl 試劑三,，10μl 蒸餾水，混勻后置于 37℃

水浴保溫 30min；立即加入 35μl 試劑五,，混勻后置于冰浴中 5min,；取出后加入 35μl 試劑六，混勻后室溫靜置 5min,；室溫 8000rpm 離心 5min,；取新的EP 管，加入 100μl 上清液,，100μl 試劑七,，混勻后 60℃水浴 10min，然后取出,，用冷水冷卻 5min,，于 412nm 測(cè)定光吸收，記為A 對(duì)照管,。

4. 測(cè)定管：取 1 支EP 管,，加入 10μl 粗酶液，170μl 試劑二,，10μl 試劑三,，10μl 試劑四，混勻后置于 37℃

水浴保溫 30min,；立即加入 35μl 試劑五,，混勻后置于冰浴中 5min；取出后加入 35μl 試劑六,，混勻后室溫靜置 5min,；室溫 8000rpm 離心 5min；取 1 支新EP 管,，加入 100μl 上清液,，100μl 試劑七，混勻后 60℃水浴 10min,，然后取出,，用冷水冷卻 5min，于 412nm 測(cè)定光吸收,，記為A 測(cè)定管,。

5. 標(biāo)準(zhǔn)管：取 1 支EP 管，加入 100μl 標(biāo)準(zhǔn)品,，100μl 試劑七,，混勻后 60℃水浴 10min，然后取出,，用冷水冷卻 5min,，于 412nm 測(cè)定光吸收,，記為A 標(biāo)準(zhǔn)管。

注意：每個(gè)樣品都需要做對(duì)照管,。

AND 活性計(jì)算：

a. 使用微量石英比色皿測(cè)定的計(jì)算公式如下

（1） 按蛋白濃度計(jì)算

活性單位定義：37℃中每分鐘每毫克蛋白催化產(chǎn)生 1nmol 甲醛為 1 個(gè)酶活單位,。

AND 活性(nmol/min/mg prot) = C 標(biāo)準(zhǔn)品× V 標(biāo)準(zhǔn)品×（A 測(cè)定管－A 對(duì)照管）÷A 標(biāo)準(zhǔn)管× 稀釋倍數(shù)÷（Cpr×V樣）÷T

= 45×（A 測(cè)定管－A 對(duì)照管）÷A 標(biāo)準(zhǔn)管÷Cpr。

（2） 按樣本質(zhì)量計(jì)算

活性單位定義：37℃中每分鐘每克組織催化產(chǎn)生 1nmol 甲醛為 1 個(gè)酶活單位,。

AND 活性(nmol/min/g 鮮重 ) = C 標(biāo)準(zhǔn)品×V 標(biāo)準(zhǔn)品×（A 測(cè)定管－A 對(duì)照管）÷A 標(biāo)準(zhǔn)管×稀釋倍數(shù)÷(V 樣

÷V 樣總×W)÷T

= 45×（A 測(cè)定管－A 對(duì)照管）÷A 標(biāo)準(zhǔn)管÷W。

C 標(biāo)準(zhǔn)品：0.05 mmol/L=50μmol/L,；V 標(biāo)準(zhǔn)品：500μl=0.0005 L,；稀釋倍數(shù)：V 反總÷V 上清液=（50+850

+50+50+175+175）÷500=2.7；Cpr：粗酶液蛋白質(zhì)濃度（mg/ml）,，需要另外測(cè)定,，建議使用本公司 BCA蛋白質(zhì)含量測(cè)定試劑盒；V 樣：加入粗酶液體積,，50μl=0.05ml,；V 樣總：提取液體積，0.5ml,；T：催化反應(yīng)時(shí)間（min）,，30min。

b. 使用 96 孔板測(cè)定的計(jì)算公式如下

（1） 按蛋白濃度計(jì)算

活性單位定義：37℃中每分鐘每毫克蛋白催化產(chǎn)生 1nmol 甲醛為 1 個(gè)酶活單位,。

AND 活性(nmol/min/mg prot) = C 標(biāo)準(zhǔn)品×V 標(biāo)準(zhǔn)品×（A 測(cè)定管－A 對(duì)照管）÷A 標(biāo)準(zhǔn)管× 稀釋倍數(shù)÷（Cpr×V樣）÷T

= 45×（A 測(cè)定管－A 對(duì)照管）÷ A 標(biāo)準(zhǔn)管÷ Cpr,。

（2） 按樣本質(zhì)量計(jì)算

活性單位定義：37℃中每分鐘每克組織催化產(chǎn)生 1nmol 甲醛為 1 個(gè)酶活單位。

AND 活性(nmol/min/g 鮮重) = C 標(biāo)準(zhǔn)品×V 標(biāo)準(zhǔn)品×（A 測(cè)定管－A 對(duì)照管）÷A 標(biāo)準(zhǔn)管×稀釋倍數(shù)÷(V 樣÷V樣總×W)÷T

= 45×（A 測(cè)定管－A 對(duì)照管）÷ A 標(biāo)準(zhǔn)管÷W,。

C 標(biāo)準(zhǔn)品：0.05 mmol/L=50μmol/L,；V 標(biāo)準(zhǔn)品：500μl=0.0005 L；稀釋倍數(shù)：V 反總÷V 上清液=（50+850

+50+50+175+175）÷500=2.7,；Cpr：粗酶液蛋白質(zhì)濃度（mg/ml）,，需要另外測(cè)定，建議使用本公司 BCA蛋白質(zhì)含量測(cè)定試劑盒,；V 樣：加入粗酶液體積,，50μl=0.05ml；V 樣總：提取液體積,，0.5 ml,；T：催化反應(yīng)時(shí)間（min），30min,。

注意事項(xiàng)：

1,、粗酶液需在當(dāng)日完成測(cè)定，如需保存,，則向粗酶液提取步驟 3 的沉淀中加 0.5ml 20%的甘油,，分裝后，

-80℃保存；

2,、試劑三和試劑四需臨用前配制,，如當(dāng)天沒(méi)有用完，4℃避光保存,，可用 1 周,；

3、粗酶液可直接用于蛋白濃度測(cè)定,，建議用 BCA 法測(cè)蛋白含量,。

氨基bi林-N-脫甲基酶活性測(cè)定試劑盒   P450