儲運條件

-20℃ 

產品組成

Fast One Step Cloning Kit 

產品簡介

Fast One Step Cloning Kit

基于重組原理的無縫克隆技術,，作為新一代的克隆方法,，不依賴繁瑣的酶切、連接步驟,，也不需要末端補平等操作,，依據DNA 片段與線性化載體末端的15~25 nt 同源序列的重組，可將插入片段克隆至任意線性載體的任意位點,，載體自連背景極低,，是一種簡單、快速,、高效的DNA 定向克隆技術,。

Fast One Step Cloning Kit 無縫克隆試劑盒，一次反應可完成單至多個DNA 片段的重組,，最快僅需5 分鐘即可完成單片段重組,，且陽性率高于95%。Kit 中添加的輔助因子,，有效提高克隆陽性率,；經優(yōu)化的反應體系，能夠一定程度上耐受未純化PCR 產物中含有的雜質,。升級版的無縫克隆試劑盒具有更高的陽性率,、更好的兼容性。

實驗步驟

1. 實驗流程概要

2. 線性化克隆載體制備

選擇合適的克隆位點,，對載體進行線性化,，載體的線性化可以通過酶切或反向PCR 擴增完成,。

① 酶切制備

一些限制性內切酶不能有效地消化超螺旋DNA,，因此可能會留下不同數量的未切割載體DNA，降低陽性率,。推薦使用LightNingTM 快速內切酶進行酶切（單酶切或者雙酶切）,，使載體線性化，以降低轉化背景（未切割的載體轉化獲得的假陽性克?。?。

注1：經酶切進行線性化的載體無需去磷酸化，推薦使用雙酶切,。

注2：酶切完成后,，建議將內切酶失活或對目的產物純化后用于重組反應。

② 反向PCR 擴增制備

為減少擴增突變的引入,，推薦使用高保真PCR Mix 進行擴增,。推薦使用預線性化質粒作為模板,，以減少環(huán)狀質粒模板殘留對克隆陽性率的影響。

注1：PCR 產物無非特異性條帶時,， 推薦使用Template Eliminator（ 貨號：EG21203）消化質粒模板即可用于重組反應,；反之建議將PCR 產物純化后使用。

注2：多片段克隆時,，建議將PCR 產物純化后使用,。

3. 插入片段PCR 引物設計

PCR 引物的5' 端必須包含與其相鄰片段（插入片段或載體）末端同源的15~25 nt（推薦18 nt）序列。假如載體為粘性末端,，且3' 端突出,，則引物設計必須包含突出部分；若5' 端突出,，則引物設計可以包含突出部分,，也可以不包含。

插入片段正向擴增引物：

5'—上游載體末端同源序列+ 酶切位點（可選）+ 基因特異性正向擴增序列— 3'

插入片段反向擴增引物：

3'—基因特異性反向擴增序列+ 酶切位點（可選）+ 下游載體末端同源序列—5'

注1：盡量選擇無重復序列且 GC 含量均勻的區(qū)域進行克隆,，當載體克隆位點上下游25 nt 區(qū)域內 GC 含量為40%~60% 時,，重組高；

注2：本試劑盒所提供的pUC 19 載體（Ampr）連接端序列如下：

4. 插入片段的PCR 擴增

推薦使用高保真PCR Mix 進行擴增,，以減少擴增突變的引入,。建議使用純化后的PCR 產物進行無縫克隆反應，若PCR 產物經瓊脂糖凝膠電泳鑒定為特異性擴增產物,，可直接使用,，但加樣體積不應超過總反應體積的20%。

5. 重組反應

① 于冰水浴中配置以下反應體系：

a. 最適載體用量(ng) = 0.02 × 載體堿基對數,，即0.03 pmol,。

b. 插入單片段，最適片段用量（ng）= 0.04 × 片段堿基對數,；插入多片段,，每片段zui適用量（ng）= 0.02 × 片段堿基對數。

注1：若插入單片段的長度大于載體,，則應互換載體與插入片段用量,；

注2：若插入片段的長度小于200 bp，則插入片段應使用5 倍載體用量,；

注3：若按上述公式計算得到的用量超過zuidi/ 最高值,，則建議直接按zui/ 最高用量使用；

注4：載體片段過長,、插入片段過長或片段數過多,，克隆陽性率均會降低。

重組反應體系配制完成后,，用移液槍輕輕吸打混勻各組分,，避免產生氣泡,，切勿渦旋。

② 將反應體系置于50℃,，反應5~60 min,。

注1：推薦使用 PCR 儀等溫控比較精準的儀器進行反應，反應時間不足或太長克隆效率均會降低,；

注2：插入1~2 個片段時,，推薦反應時間為5~15 min；插入3~5 個片段時,，推薦反應時間為15~30 min,；

注3：當載體骨架在10 kb 以上或插入片段在4 kb 以上時，建議延長反應時間到30~60 min,；

注4：50℃反應完成后,，建議進行瞬時離心，將反應液收集至管底,。

③ 將反應液離心管置于冰上冷卻,，之后進行轉化或者儲存于 -20℃。

注 1： -20℃儲存的重組產物,，建議在 1 周內使用,。

6. 重組產物轉化

取5~10 μl 反應液，加入到100 μl 感受態(tài)細胞中,，緩慢吸打混勻,，冰上放置30 min。42℃ 熱激45~60 sec,，冰浴5 min,。加500 μl SOC或 LB 培養(yǎng)基，37℃ 振蕩培養(yǎng)40~60 min（200 rpm）,。將菌液均勻涂布在含有對應抗生素的平板上,，倒置于37℃ 過夜培養(yǎng)。

注1：不同感受態(tài)細胞最后的克隆陽性率會有所差別,，推薦使用轉化效率 > 108 CFU/μg的感受態(tài)細胞,；

注2：菌落數取決于PCR 產物與線性化載體的數量和純度；

注3：陽性對照平板通常生長大量白色單菌落,，陰性對照平板只生長很少的菌落。

7. 陽性克隆檢測

挑取單菌落至10 μl ddH2O 中混勻,，95℃裂解10 min 后,，取1 μl裂解液作為模板，進行菌落PCR 鑒定,，或將單菌落接種至抗性培養(yǎng)基中培養(yǎng)過夜后,，提取質粒進行酶切鑒定,。

陽性對照的陽性克隆檢測，菌落PCR 引物使用通用引物M13F 與M13R,，酶切鑒定用HindIII 與EcoRI,。

注1：菌落PCR 時建議至少使用一條通用引物，避免假陽性結果,；

注2：必要時可進一步對陽性結果進行測序鑒定,。

注3：M13F：TGTAAAACGACGGCCAGT

M13R：CAGGAAACAGCTATGAC

美國Azaood公司成立于2004年，是一家開發(fā)和生產用于生命科學研究,、診斷和生物技術應用的高質量純化酶,、蛋白質、核酸和細胞分離試劑盒,、胎牛血清的行業(yè)lingdao者,；Azood公司是通過了ISO9001認證的主要制造商，可以滿足從研究到大規(guī)模批量生物加工和OEM應用與要求的公司,。