型號： AZ00008 

儲(chǔ)運(yùn)條件

-20℃

產(chǎn)品組成

產(chǎn)品簡介

基于重組原理的無縫克隆技術(shù),，作為新一代的克隆方法，不依賴繁瑣的酶切,、連接步驟,，也不需要末端補(bǔ)平等操作,，依據(jù)DNA 片段與線性化載體末端的15~25 nt 同源序列的重組，可將插入片段克隆至任意線性載體的任意位點(diǎn),，載體自連背景低,，是一種簡單、快速的DNA 定向克隆技術(shù),。

Fast One Step Cloning Kit 無縫克隆試劑盒,，一次反應(yīng)可完成單至多個(gè)DNA 片段的重組，快僅需5 分鐘即可完成單片段重組,，且陽性率高于95%,。Kit 中添加的輔助因子，有效提高克隆陽性率,；經(jīng)優(yōu)化的反應(yīng)體系,，能夠一定程度上耐受未純化PCR 產(chǎn)物中含有的雜質(zhì)。升版的無縫克隆試劑盒具有更高的陽性率,、更好的兼容性,。

實(shí)驗(yàn)步驟

1. 實(shí)驗(yàn)流程概要

2. 線性化克隆載體制備

選擇合適的克隆位點(diǎn)，對載體進(jìn)行線性化,，載體的線性化可以通過酶切或反向PCR 擴(kuò)增完成。

① 酶切制備

一些限制性內(nèi)切酶不能有效地消化超螺旋DNA,，因此可能會(huì)留下不同數(shù)量的未切割載體DNA,，降低陽性率。推薦使用LightNingTM 快速內(nèi)切酶進(jìn)行酶切（單酶切或者雙酶切）,，使載體線性化wanquan,，以降低轉(zhuǎn)化背景（未切割的載體轉(zhuǎn)化獲得的假陽性克隆）,。

注1：經(jīng)酶切進(jìn)行線性化的載體無需去磷酸化,，推薦使用雙酶切。

注2：酶切完成后,，建議將內(nèi)切酶失活或?qū)δ康漠a(chǎn)物純化后用于重組反應(yīng),。

② 反向PCR 擴(kuò)增制備

為減少擴(kuò)增突變的引入，推薦使用高保真PCR Mix 進(jìn)行擴(kuò)增,。推薦使用預(yù)線性化質(zhì)粒作為模板,，以減少環(huán)狀質(zhì)粒模板殘留對克隆陽性率的影響。

注1：PCR 產(chǎn)物無非特異性條帶時(shí),， 推薦使用Template Eliminator（ 貨號：EG21203）消化質(zhì)粒模板即可用于重組反應(yīng),；反之建議將PCR 產(chǎn)物純化后使用,。

注2：多片段克隆時(shí)，建議將PCR 產(chǎn)物純化后使用,。

3. 插入片段PCR 引物設(shè)計(jì)

PCR 引物的5' 端必須包含與其相鄰片段（插入片段或載體）末端同源的15~25 nt（推薦18 nt）序列,。假如載體為粘性末端，且3' 端突出,，則引物設(shè)計(jì)必須包含突出部分,；若5' 端突出，則引物設(shè)計(jì)可以包含突出部分,，也可以不包含,。

插入片段正向擴(kuò)增引物：

5'—上游載體末端同源序列+ 酶切位點(diǎn)（可選）+ 基因特異性正向擴(kuò)增序列— 3'

插入片段反向擴(kuò)增引物：

3'—基因特異性反向擴(kuò)增序列+ 酶切位點(diǎn)（可選）+ 下游載體末端同源序列—5'

注1：盡量選擇無重復(fù)序列且 GC 含量均勻的區(qū)域進(jìn)行克隆，當(dāng)載體克隆位點(diǎn)上下游25 nt 區(qū)域內(nèi) GC 含量為40%~60% 時(shí),，重組效率高,；

注2：本試劑盒所提供的pUC 19 載體（Ampr）連接端序列如下：

4. 插入片段的PCR 擴(kuò)增

推薦使用高保真PCR Mix 進(jìn)行擴(kuò)增，以減少擴(kuò)增突變的引入,。建議使用純化后的PCR 產(chǎn)物進(jìn)行無縫克隆反應(yīng),，若PCR 產(chǎn)物經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳鑒定為特異性擴(kuò)增產(chǎn)物，可直接使用,，但加樣體積不應(yīng)超過總反應(yīng)體積的20%,。

5. 重組反應(yīng)

① 于冰水浴中配置以下反應(yīng)體系：

a. 適載體用量(ng) = 0.02 × 載體堿基對數(shù)，即0.03 pmol,。

b. 插入單片段,，適片段用量（ng）= 0.04 × 片段堿基對數(shù)；插入多片段,，每片段適用量（ng）= 0.02 × 片段堿基對數(shù),。

注1：若插入單片段的長度大于載體，則應(yīng)互換載體與插入片段用量,；

注2：若插入片段的長度小于200 bp,，則插入片段應(yīng)使用5 倍載體用量；

注3：若按上述公式計(jì)算得到的用量超過低/ 高值,，則建議直接按低/ 高用量使用,；

注4：載體片段過長、插入片段過長或片段數(shù)過多,，克隆陽性率均會(huì)降低,。

重組反應(yīng)體系配制完成后，用移液槍輕輕吸打混勻各組分,，避免產(chǎn)生氣泡,，切勿渦旋。

② 將反應(yīng)體系置于50℃,，反應(yīng)5~60 min,。

注1：推薦使用 PCR 儀等溫控比較jingzhun的儀器進(jìn)行反應(yīng),，反應(yīng)時(shí)間不足或太長克隆效率均會(huì)降低；

注2：插入1~2 個(gè)片段時(shí),，推薦反應(yīng)時(shí)間為5~15 min,；插入3~5 個(gè)片段時(shí)，推薦反應(yīng)時(shí)間為15~30 min,；

注3：當(dāng)載體骨架在10 kb 以上或插入片段在4 kb 以上時(shí),，建議延長反應(yīng)時(shí)間到30~60 min；

注4：50℃反應(yīng)完成后,，建議進(jìn)行瞬時(shí)離心,，將反應(yīng)液收集至管底。

③ 將反應(yīng)液離心管置于冰上冷卻,，之后進(jìn)行轉(zhuǎn)化或者儲(chǔ)存于 -20℃,。

注 1： -20℃儲(chǔ)存的重組產(chǎn)物，建議在 1 周內(nèi)使用,。

6. 重組產(chǎn)物轉(zhuǎn)化

取5~10 μl 反應(yīng)液,，加入到100 μl 感受態(tài)細(xì)胞中，緩慢吸打混勻,，冰上放置30 min,。42℃ 熱激45~60 sec，冰浴5 min,。加500 μl SOC或 LB 培養(yǎng)基,，37℃ 振蕩培養(yǎng)40~60 min（200 rpm）。將菌液均勻涂布在含有對應(yīng)抗生素的平板上,，倒置于37℃ 過夜培養(yǎng),。

注1：不同感受態(tài)細(xì)胞后的克隆陽性率會(huì)有所差別，推薦使用轉(zhuǎn)化效率 > 108 CFU/μg的感受態(tài)細(xì)胞,；

注2：菌落數(shù)取決于PCR 產(chǎn)物與線性化載體的數(shù)量和純度；

注3：陽性對照平板通常生長大量白色單菌落,，陰性對照平板只生長很少的菌落,。

7. 陽性克隆檢測

挑取單菌落至10 μl ddH2O 中混勻，95℃裂解10 min 后,，取1 μl裂解液作為模板,，進(jìn)行菌落PCR 鑒定，或?qū)尉浣臃N至抗性培養(yǎng)基中培養(yǎng)過夜后,，提取質(zhì)粒進(jìn)行酶切鑒定,。

陽性對照的陽性克隆檢測，菌落PCR 引物使用通用引物M13F 與M13R,，酶切鑒定用HindIII 與EcoRI,。

注1：菌落PCR 時(shí)建議至少使用一條通用引物,，避免假陽性結(jié)果；

注2：必要時(shí)可進(jìn)一步對陽性結(jié)果進(jìn)行測序鑒定,。

注3：M13F：TGTAAAACGACGGCCAGT

M13R：CAGGAAACAGCTATGAC

原創(chuàng)作者：上海創(chuàng)凌生物科技有限公司