AscI 快速內(nèi)切酶

產(chǎn)品貨號：F5508s

儲存條件：-20℃                                      

同裂酶：PalAI, SgsI

注：同裂酶對于不同的甲基化修飾也許具有不同敏感性。

產(chǎn)品組成

產(chǎn)品簡介

LabFD™快速內(nèi)切酶是一系列經(jīng)過基因工程重組,、能夠在5~15分鐘內(nèi)精確完成DNA切割的高保真限制性內(nèi)切酶,，適用于質(zhì)粒DNA、PCR產(chǎn)物或基因組DNA等的快速酶切,。LabFD™快速內(nèi)切酶具有如下特點(diǎn)：5~15分鐘內(nèi)即可完成酶切,；共用一種酶切Buffer，大大簡化酶切反應(yīng)體系,；良好的酶活冗余度,，輕松應(yīng)對底物過量或困難模板酶切。此外,，LABLEAD去磷酸化,、連接試劑在LabFD™酶切Buffer中具有100%活性，支持一管化反應(yīng),，提升“酶切-修飾-連接”的體驗(yàn),。

建議反應(yīng)條件

1×LabFD™緩沖液；

37℃溫育,；

參照“DNA快速酶切流程”配制反應(yīng)體系,。

失活條件

80℃溫育20min。

質(zhì)量控制

功能活性檢測

最適反應(yīng)溫度下，在20ul反應(yīng)體系中，1ul LabFD™ AscI能夠在15min內(nèi)wanquan消化1ug  λDNA(HindIII digest)。

超長時間溫育檢測

最適反應(yīng)溫度下,，將1ul LabFD™ AscI與1ug λDNA(HindIII digest共同溫育3h，未檢測到其他核酸酶污染或星號活性引起的底物非特異性降解,，延時酶切可能出現(xiàn)星號活性。

酶切-連接-再酶切檢測

最適反應(yīng)溫度下,，使用1ul LabFD™ AscI消化底物,，回收酶切產(chǎn)物。在22℃下使用適量Fast T4 DNA Ligase可以將酶切產(chǎn)物重新連接,。將連接產(chǎn)物再次回收后,，使用相同的內(nèi)切酶可以重新切開連接產(chǎn)物。

非特異性內(nèi)切酶活性檢測

最適反應(yīng)溫度下,，將1ul LabFD™ AscI與1ug超螺旋質(zhì)粒DNA共同溫育4h,，使用瓊脂糖凝膠電泳檢測，質(zhì)粒DNA仍然處于超螺旋狀態(tài),。

藍(lán)白斑檢測

將含有單一lacZα基因的載體以1ul LabFD™ AscI消化,，重新連接后轉(zhuǎn)化入大腸桿菌感受態(tài)細(xì)胞，涂布在含有對應(yīng)抗生素,、IPTG和X-gal的LB培養(yǎng)基平板上,。連接正確的產(chǎn)物會生長出藍(lán)色菌落，而連接錯誤（即 DNA 末端切口不完整）的產(chǎn)物將得到白色菌落,。對于 LabFD™系列限制酶而言,，白色菌落比例應(yīng)小于1%。

使用方法

1.DNA快速酶切流程

1）在冰上按如下建議的加樣順序配制反應(yīng)體系：

注：本體系適用于經(jīng)過純化的PCR產(chǎn)物酶切,，未純化的PCR具備一定的離子強(qiáng)度,，10xLabFD^TMbuffer加入量可適當(dāng)減少至2ul。但由于DNA聚合酶同時具有外切酶活性,，會影響酶切產(chǎn)物，因此如下一步需進(jìn)行克

隆等操作,，建議酶切前對PCR產(chǎn)物進(jìn)行純化,。

2）輕柔吸打或輕彈管壁以混勻（切勿渦旋），然后瞬時離心以收集掛壁液滴,；

3）37℃溫育15min（質(zhì)粒）,，或15~30min（PCR產(chǎn)物），或30~60min（基因組DNA）,；

4）80℃溫育20min即可使酶失活,，停止反應(yīng)。

2.雙酶切或多酶切

1）每種快速內(nèi)切酶的用量為1ul，并根據(jù)需要適當(dāng)擴(kuò)大反應(yīng)體系,；

2）所有快速內(nèi)切酶的體積總和不得超過總反應(yīng)體系的1/10,；

3）如果所用的幾種快速內(nèi)切酶的最適反應(yīng)溫度不同，應(yīng)先以最適溫度低的酶開始酶切,，再添加最適溫度較高的酶,，在其最適反應(yīng)溫度下進(jìn)行酶切反應(yīng)。

3.適用于質(zhì)粒的擴(kuò)大反應(yīng)體系

注：如果總反應(yīng)體系大于20ul,，應(yīng)適當(dāng)增加溫育時間,，盡量使用水浴、金屬浴或沙浴,。

不同DNA中的酶切位點(diǎn)數(shù)量

甲基化修飾影響

在不同反應(yīng)緩沖液中的活性

注：活性數(shù)據(jù)來自LABLEAD限制酶標(biāo)準(zhǔn)反應(yīng)體系下的檢測,。