原代CIK細(xì)胞培養(yǎng)體系
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- 公司名稱 上海倍維敏科技有限公司
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- 更新時(shí)間 2025/4/8 18:37:34
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原代CIK細(xì)胞培養(yǎng)體系參數(shù)：
產(chǎn)品規(guī)格：100ml/500ml
產(chǎn)品規(guī)格：100ml/500ml
產(chǎn)品貨號(hào)：PriMed-Biowm-039
保存溫度（℃）：2-8℃/-20℃
運(yùn)輸溫度（℃）：2-8℃/-20℃
凍存培養(yǎng)基：
凍存細(xì)胞時(shí)必須使用的凍存培養(yǎng)基,。凍存培養(yǎng)基中應(yīng)含有 DMSO 或者甘油等冷凍保護(hù)劑。還可使用專門配制的凍存培養(yǎng)基,。
1）細(xì)胞凍存培養(yǎng)基是一種用于哺乳動(dòng)物細(xì)胞的即用型凍存培養(yǎng)基,，其含胎牛血清和牛血清比例經(jīng)過(guò)優(yōu)化，可改善細(xì)胞活力以及解凍后的細(xì)胞復(fù)蘇效果,。
2）凍存培養(yǎng)基是一種化學(xué)成分確定的,、無(wú)蛋白、無(wú)菌凍存培養(yǎng)基,，含10% DMSO,，適用于多種干細(xì)胞和原代細(xì)胞 (黑色素細(xì)胞除外) 的凍存。
培養(yǎng)細(xì)胞凍存方案：
以下實(shí)驗(yàn)方案介紹了培養(yǎng)細(xì)胞凍存的一般流程,。詳細(xì)的實(shí)驗(yàn)方案,，必須參閱針對(duì)具體細(xì)胞的產(chǎn)品說(shuō)明書。
1.配制凍存培養(yǎng)基,，于2°C至8°C下儲(chǔ)存,，直至使用。請(qǐng)注意使用何種凍存培養(yǎng)基取決于用細(xì)胞系,。
2.凍存貼壁細(xì)胞時(shí),，利用傳代時(shí)用方法輕柔地使細(xì)胞從組織培養(yǎng)容器上脫離下來(lái)。用該細(xì)胞需培養(yǎng)基重新懸浮細(xì)胞,。
3.采用血球計(jì)數(shù)器,、細(xì)胞計(jì)數(shù)儀按照臺(tái)盼藍(lán)拒染法或者使用自動(dòng)細(xì)胞計(jì)數(shù)儀測(cè)定細(xì)胞數(shù)和活細(xì)胞百分比。根據(jù)需活細(xì)胞密度,，計(jì)算凍存培養(yǎng)基需要量,。
4.以大約100-200×g的離心力將細(xì)胞懸液離心5至10分鐘。在無(wú)菌條件下小心倒掉上清液,，不要攪動(dòng)細(xì)胞沉淀,。
注：離心速度和時(shí)間取決于細(xì)胞種類。
5.用預(yù)冷的凍存培養(yǎng)基重新懸浮細(xì)胞沉淀,，將其調(diào)整至該細(xì)胞適合的活細(xì)胞密度,。
6.將細(xì)胞懸液分裝到若干凍存管中。分裝時(shí),，應(yīng)不時(shí)輕輕混合細(xì)胞,，使其保持均勻的細(xì)胞懸液狀態(tài)。
7.使用可控制降溫速度的冷凍裝置冷凍細(xì)胞,，使溫度每分鐘大約降低 1°C,?；蛘撸瑢⒀b有細(xì)胞的凍存管放入凍存盒中,，然后將凍存盒置于-80°C條件下*,。
實(shí)驗(yàn)材料：
1. 50ml 配制好的RPMI1640培養(yǎng)液1瓶；8ml小牛血清（FCS) 1瓶,；100ml 0.25%胰蛋白酶 1瓶,；PBS(-)1 瓶
2. 100ml滅菌燒杯2個(gè)； 人皮膚成纖維細(xì)胞,CCC-HSF-1細(xì)胞
3,、50ml離心筒2個(gè)
4,、滅菌培養(yǎng)皿1個(gè)，細(xì)胞培養(yǎng)瓶1個(gè)
5,、1ml ,，200μl移液器各1支；槍頭盒2個(gè),；無(wú)菌玻璃攪拌棒1個(gè)
6,、細(xì)胞計(jì)數(shù)板1塊；
7,、滅好菌的鑷子1把,，剪刀1把；
8,、酒精燈1臺(tái),；
實(shí)驗(yàn)報(bào)告：
一、分離與培養(yǎng)：
1,、無(wú)菌條件下,，取出1-3d 齡SD大鼠心房組織，然后用PBS將此組織塊清洗2次,，*將組織剪成1mm3左右大?。?/span>
2,、往組織塊中加入4 mL酶消化液（0.1% 胰酶和0.1% I型膠原酶）,，混懸10s，置37℃條件下消化10min,，之后用滴管吹打制成單細(xì)胞懸液,，自然沉淀并收集上清，用含10% FBS培養(yǎng)基終止消化后4℃放置,；
3、剩下的組織再加入3～4mL酶消化液,，混懸10s,，置37℃消化10 min后,，按上述方法收集上清并終止消化后4℃放置，重復(fù)此步驟2-3次,，直至組織被消化,；
4、用200目不銹鋼篩網(wǎng)過(guò)濾細(xì)胞消化液,，1200r/min 離心10min,，棄去上清，沉淀細(xì)胞用含有10％ FBS DMEM/F12培養(yǎng)基混懸,，接種于25cm2培養(yǎng)瓶,，放置于37℃ ，5％CO2 培養(yǎng)箱中培養(yǎng),；
5,、差速貼壁1h后，吸出培養(yǎng)基,，按實(shí)驗(yàn)需要接種于6孔板中繼續(xù)培養(yǎng),；
二、免疫熒光：
1,、待心房肌細(xì)胞生長(zhǎng)至80%融合時(shí),，棄去培養(yǎng)基，用溫育的PBS沖洗細(xì)胞2次,，每次10min,，然后用4%多聚甲醛在室溫條件下固定細(xì)胞15min；
2,、PBS沖洗細(xì)胞2次,，每次10min，然后在4℃條件下,，用0.1％Triton X-100透膜15min,；
3、PBS沖洗細(xì)胞2次,，每次10min,，然后在室溫條件下，用4% BSA封閉細(xì)胞30min,；
4,、按1: 100的比例稀釋α-actin一抗，然后將其放在4℃冰箱中孵育細(xì)胞*,；
5,、PBS沖洗細(xì)胞3次，每次10min，按1：150的比例稀釋抗α-actin的二抗,， 37℃條件下放置1h,；
6、用PBS沖洗3次,，每次10min,，*在倒置熒光顯微鏡下觀察圖像并拍照。
細(xì)胞培養(yǎng)的優(yōu)點(diǎn)：
1.研究的對(duì)象是活細(xì)胞
在實(shí)驗(yàn)過(guò)程中,，根據(jù)要求可始終保持細(xì)胞活力,，并可長(zhǎng)時(shí)間監(jiān)控、檢測(cè)甚至定量評(píng)估一部分活細(xì)胞的情況,，包括活細(xì)胞的形態(tài),、結(jié)構(gòu)、生命活動(dòng)等,。
2.研究條件可以人為控制
pH,、溫度、氧氣,、二氧化碳,、張力等物理化學(xué)的條件，可以根據(jù)實(shí)際需要進(jìn)行人為的控制,，同時(shí),，可以施加化學(xué)、物理,、生物等因素作為條件而進(jìn)行實(shí)驗(yàn)觀察,，這些因素同樣可以處于嚴(yán)格控制之下。
3.研究的樣本可以達(dá)到比較均一性
通過(guò)細(xì)胞培養(yǎng)一定代數(shù)后,，得到的細(xì)胞系則可以達(dá)到均一性而屬于同一類型的細(xì)胞,，需要時(shí)，可采用克隆化等方法使細(xì)胞達(dá)到純化,。
4.研究?jī)?nèi)容便于觀察,、檢測(cè)和記錄
采用各種研究技術(shù)：如倒置生物顯微鏡、熒光顯微鏡,、電子顯微鏡,、流式細(xì)胞術(shù)、激光共焦顯微鏡,、免疫組織化學(xué),、原位雜交、同位素標(biāo)記等各種儀器設(shè)備,。
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