組氨酸標(biāo)簽蛋白親和純化介質(zhì)過(guò)濾層析法 Ni IDA Beads填料

      Ni IDA Beads可以用于各種表達(dá)來(lái)源（如大腸桿菌,、酵母、昆蟲(chóng)細(xì)胞和哺乳動(dòng)物細(xì)胞）的組氨酸標(biāo)簽（6xHis-tagged）蛋白的純化,。它是以4%瓊脂糖凝膠為基質(zhì),，通過(guò)化學(xué)方法偶聯(lián)了三配位的亞氨基二乙酸（IDA），螯合鎳離子（Ni2+）后,，可以形成比較穩(wěn)定的平面四邊形結(jié)構(gòu),，從而有更多的位點(diǎn)與組氨酸標(biāo)簽上的咪唑環(huán)繼續(xù)配位，達(dá)到結(jié)合目的蛋白的效果,。但是,，這樣的結(jié)構(gòu)比較容易受到其他小分子的進(jìn)攻，鎳離子易被還原或者被螯合,，從而破壞其化學(xué)結(jié)構(gòu),，無(wú)法結(jié)合目的蛋白。Ni IDA Beads具有載量高,，性能和價(jià)值匹配等優(yōu)點(diǎn),。

表1. Ni IDA Beads產(chǎn)品性能

2.純化流程

2.1 緩沖液的準(zhǔn)備

可使用下列推薦緩沖液，也可根據(jù)自己的使用習(xí)慣配置不同的緩沖液體系,，基本原理就是低咪唑上樣,，高咪唑洗脫。緩沖液在使用前盡量用0.22 μm 或者0.45 μm 濾膜過(guò)濾除菌,。具體配置方法見(jiàn)表2,。

組氨酸標(biāo)簽蛋白親和純化介質(zhì)過(guò)濾層析法 Ni IDA Beads填料純化蛋白流程：

2.2.1 細(xì)菌或酵母表達(dá)的蛋白

1）挑取單菌落到培養(yǎng)基中，根據(jù)載體使用說(shuō)明,，加入相應(yīng)濃度的誘導(dǎo)劑誘導(dǎo)相應(yīng)的時(shí)間,。

2）表達(dá)結(jié)束后，將培養(yǎng)液轉(zhuǎn)移到離心杯中,，7,，000 rpm（7,，500×g），離心15min 收集菌體,，然后按照菌體∶Lysis Buffer=1∶10（WNV）加入

Lysis Buffer,，加入終濃度為 1mM的 PMSF。加入溶菌酶（工作濃度為 0.2-0.4 mg/ml,，如果表達(dá)的宿主細(xì)胞內(nèi)含 pLysS 或 pLysE,，可以不加溶菌酶），同時(shí)也可加入其他蛋白酶抑制劑,，但不能影響目的蛋白與樹(shù)脂的結(jié)合）,。

3）將菌體沉淀懸浮起來(lái)，（如果菌液濃度高,，也可考慮加入10 ug/ml RNase A和5 μg/ml DNase I）,，混勻，放置于冰上,，然后冰上超聲破碎細(xì)胞,，至菌液基本保持澄清。

4）將澄清的破碎液轉(zhuǎn)移至離心管中,，10,，000 rpm（15，000×g）,，4℃離心 20-30 min,。取上清，置于冰上備用或-20℃保存,。

2.2.2 酵母,、昆蟲(chóng)和哺乳細(xì)胞分泌表達(dá)可溶性蛋白

1）將細(xì)胞培養(yǎng)液轉(zhuǎn)移至離心杯，5.000 rpm（3.800×g）;離心10min,，收集菌體得上清,，如上清中不含 EDTA、組氨酸和還原劑等物質(zhì),，即可直接加入柱子使用;如含有 EDTA,、組氨酸和還原劑等物質(zhì)，需用Lysis Buffer 透析才能加入柱子,。2）對(duì)于大量體積的上清,，需加入硫酸銨沉淀濃縮后，蛋白還需用 Lysis Buffer 透析后才能加入柱子,。

2.3 Ni IDA Beads 重力柱的裝填

1）取合適規(guī)格的重力層析柱,，裝入下墊片，加入適量純水潤(rùn)洗柱管和墊片,，關(guān)閉下出口。

2）將 Ni IDA Beads 混合均勻，用槍頭吸取適量漿液加入至重力柱中（介質(zhì)實(shí)際體積占懸液的一半）,，打開(kāi)下出口流干保護(hù)液,。

3）加入適量純水沖洗介質(zhì)，待柱管中液體重力流干后,，關(guān)閉下出口,。

4）裝入潤(rùn)洗后的上墊片，確保墊片與填料之前沒(méi)有空隙,，且保持水平,。

5）裝填好的重力柱可以直接加入平衡液進(jìn)行平衡，暫不使用時(shí)則加入保護(hù)液,，4-30℃保存,。

     蘇州阿爾法生物提供的瓊脂糖凝膠介質(zhì)、葡聚糖凝膠介質(zhì)等蛋白純化和分離填料以及相關(guān)生物試劑,。另外還提供,、氨酸標(biāo)簽蛋白親和純化介質(zhì)、GST-tag蛋白親和純化介質(zhì),、 MBP-tag蛋白親和純化介質(zhì),、Biotin-tag蛋白親和純化介質(zhì)、Strep-tagll標(biāo)簽親和純化介質(zhì),、 標(biāo)簽抗體親和純化介質(zhì)等標(biāo)簽蛋白親和層析介質(zhì),； 離子交換層析 、色譜柱,、離子交換層析樹(shù)脂,、疏水層析介質(zhì)、 磁性微球等,。