一,、蛋白雙向 電泳實驗服務(wù)實驗技術(shù)簡介

2D-WB是雙向電泳與傳統(tǒng)western blot結(jié)合而成的一項技術(shù)。一般實驗流程 為抗原蛋白混合物先經(jīng)雙向電泳分離,然后將凝膠蛋白轉(zhuǎn)印至支持膜上,，再通過抗體雜交顯色,。2D-WB技術(shù)可以檢測到抗原等電點或分子量發(fā)生的微小變化，在蛋白翻譯后修飾的研究中有很好的應(yīng)用;而2D-WB結(jié)合質(zhì)譜鑒定技術(shù)，可以從蛋白混合物中找到免疫原性更強的抗原,。

二,、蛋白雙向 電泳實驗服務(wù)概述

2D-WB是雙向電泳與傳統(tǒng)western blot結(jié)合而成的一項技術(shù)。一般實驗流程 為抗原蛋白混合物先經(jīng)雙向電泳分離,，然后將凝膠蛋白轉(zhuǎn)印至支持膜上,，再通過抗體雜交顯色。2D-WB技術(shù)可以檢測到抗原等電點或分子量發(fā)生的微小變化,，在蛋白翻譯后修飾的研究中有很好的應(yīng)用;而2D-WB結(jié)合質(zhì)譜鑒定技術(shù),，可以從蛋白混合物中找到免疫原性更強的抗原。

三,、服務(wù)內(nèi)容

1,、蛋白質(zhì)抽提與定量;

2、雙向電泳;

3,、轉(zhuǎn)膜,，封閉，孵育,顯示成像,。

四,、實驗操作流程

1、第--項電泳(IEF) ,膠條平衡,，第二項電泳SDS-APGE.

2,、第二項電泳結(jié)束后，取出凝膠進行轉(zhuǎn)膜,，轉(zhuǎn)膜方法可選擇濕法轉(zhuǎn)移和半干法轉(zhuǎn)移,。常用的膜是NC膜和PVDF膜。

3,、封閉,，5%脫脂奶粉或5% BSA封閉1小時(室溫)或過夜(4度)。

4,、一抗孵育,根據(jù)抗體說明書選擇孵育時間,，常規(guī)的孵育條件是室溫1小時或4度過夜，一抗孵育后取出膜

TBST洗滌3次,，每次5分鐘,。

5、二抗孵育:根據(jù)一抗選擇合適的二抗(抗鼠,、抗人、抗兔等),，室溫孵育1小時后取出膜TBST洗滌3次,每次5分鐘,。

6、顯影:將A,、B底物按比例稀釋混臺均勻后滴在膜上,，暗室中將膠片置于膜上,蓋上壓片夾,曝光一定時間后將膠片放入顯影液中進行顯影,，直到出現(xiàn)清晰的蛋白質(zhì)條帶，清水漂洗一下后在定影液中定影,， 曝光時間需綜臺考慮蛋白質(zhì)的上樣量,，抗體稀釋濃度，抗體孵育時間等因素,。

7,、定影后，清洗膠片,，晾干,，標定marker,掃描圖片和2D Western blot圖片分析。

送樣須知,，為了保證2D Western blot技術(shù)服務(wù)能順利進行,樣品寄送需滿足以下要求:

1,、顧客提供:組織、細胞,、蛋白質(zhì)溶液等; 一抗(可交由研謹公司代購),。

2、運輸要求:干冰或液氮包裝寄送,。

注:樣本應(yīng)避免各類污染和反復(fù)凍融,。

五、技術(shù)服務(wù)報告內(nèi)容

1,、蛋白質(zhì)定量結(jié)果及電泳上樣量;

2,、原始膠片、電子圖片及圖片分析結(jié)果;

3,、2D Western blot完整的實驗報告,，包括實驗步驟、使用儀器和試劑等,。

附: 2D Western blot實驗步驟

1,、2D Western blot蛋白質(zhì)樣本制備,制備的主要原則是盡可能溶解全部蛋白質(zhì)，破壞蛋白質(zhì)與蛋白質(zhì)間的相互作用,，避免各類干擾物質(zhì),，樣品制備與IEF兼容等。

2,、雙向電泳的主要步驟,，第-項電(IEF) ，膠條平衡,，第二項電泳SDS-APGE.

3,、第二項電泳結(jié)束后，取出凝膠進行轉(zhuǎn)膜，轉(zhuǎn)膜方法可選擇濕法轉(zhuǎn)移和半干法轉(zhuǎn)移,。常用的膜是NC膜和PVDF膜,。

4、封閉,， 5%脫脂奶粉或5% BSA封閉1小時(室溫)或過夜(4度),。

5、-抗孵育,根據(jù)抗體說明書選擇孵育時間,，常規(guī)的孵育條件是室溫1小時或4度過夜,，一 抗孵育后取出膜TBST洗滌3次，每次5分鐘,。

6,、二抗孵育:根據(jù)-抗選擇合適的二抗(抗鼠、抗人抗兔等),， 室溫孵育1小時后取出膜TBST洗滌3次,，每次5分鐘。

7,、顯影:將A,、B底物按比例稀釋混合均勻后滴在膜上,暗室中將膠片置于膜上，蓋上壓片夾,，曝光一定時間后將膠片放入顯影液中進行顯影,，直到出現(xiàn)清晰的蛋白質(zhì)條帶，清水漂洗一下后在定影液中定影,， 曝光時間需綜合考慮蛋白質(zhì)的.上樣量,，抗體稀釋濃度，抗體孵育時間等因素,。

8,、定影后，清洗膠片,，晾干,，標定marker,掃描圖片和2D Western blot圖片分析。

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