線粒體復(fù)合體Ⅴ試劑盒說明書
- 公司名稱 上海研謹生物科技有限公司
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- 廠商性質(zhì) 經(jīng)銷商
- 更新時間 2025/1/14 11:27:24
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公司主營: 各種實驗代做:WB代做,,免疫組化,,PCR代做,細胞檢測,,食品安全檢測試劑,,獸藥殘留檢測試劑,動物疫病類檢測,,銷售高品質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)品,,對照品,,ELISA試劑盒,細胞,,血清,,等等
供貨周期 | 現(xiàn)貨 | 應(yīng)用領(lǐng)域 | 醫(yī)療衛(wèi)生,環(huán)保,食品,化工,生物產(chǎn)業(yè) |
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貨號:YJ1219 規(guī)格:100管/48樣
線粒體復(fù)合體Ⅴ試劑盒說明書
微量法
正式測定前務(wù)必取2-3個預(yù)期差異較大的樣本做預(yù)測定
測定意義:
線粒體復(fù)合體Ⅴ又稱F1F0-ATP合酶,廣泛存在于動物,、植物,、微生物和培養(yǎng)細胞的線粒體中,由F1和F0兩個亞單位組成,。該酶利用呼吸鏈產(chǎn)生的質(zhì)子電化學(xué)梯度催化ATP合成,,也可逆過程水解ATP。此外,,復(fù)合體Ⅴ還存在于葉綠體,、異養(yǎng)菌和光合細菌中。復(fù)合體Ⅴ是線粒體氧化磷酸化和葉綠體光合磷酸化合成ATP的關(guān)鍵酶,。
測定原理:
復(fù)合體Ⅴ水解ATP產(chǎn)生ADP和Pi,,通過測定Pi增加速率來測定復(fù)合體Ⅴ活性。
需自備的儀器和用品:
可見分光光度計/酶標(biāo)儀,、臺式離心機,、水浴鍋、可調(diào)式移液器,、微量石英比色皿/96 孔板、研缽,、冰和蒸餾水,。
試劑的組成和配制:
試劑一:100mL×1 瓶,-20℃保存,;
試劑二:80mL×1 瓶,,-20℃保存;
試劑三:2mL×1 瓶,,-20℃保存,;
試劑四:粉劑×1 支,-20℃保存,;臨用前加入2mL蒸餾水,,充分溶解備用,用不完的試劑仍-20℃保存;
試劑五:8mL×1 瓶,,4℃保存,;
試劑六:粉劑×1 瓶,4℃保存,;臨用前加入4mL蒸餾水,,充分混勻,;溶解后4℃保存一周;
試劑七:粉劑×1瓶, 4℃保存,;臨用前加入10mL蒸餾水,,充分混勻;溶解后4℃保存一周,;
試劑八:粉劑×1瓶, 4℃保存,;臨用前加入10mL蒸餾水,充分混勻,;溶解后4℃保存一周,;
試劑九:液體 10mL×1 瓶,室溫保存,。
定磷試劑的配制:按H2O: 試劑七:試劑八:試劑九=2:1:1:1 的比例配制,,配好的定磷試劑應(yīng)為淺黃色。若無色則試劑失效,,若是藍色則為磷污染(請根據(jù)需要,,用多少配多少)。
注意:配試劑建議用新的燒杯,、玻棒和玻璃移液器,,或者一次性塑料器皿,以避免磷污染,。
樣本的前處理:
組織,、細菌或細胞中胞漿蛋白與線粒體蛋白的分離:
① 準(zhǔn)確稱取0.1g組織或收集500萬細胞,加入1mL試劑一和10uL試劑三,,用冰浴勻漿器或研缽勻漿,。
② 將勻漿 600g,4℃離心 5min,。
③ 棄沉淀,,將上清液移至另一離心管中,11000g,,4℃離心 10min,。
④ 上清液即為除去線粒體的胞漿蛋白,可用于測定從線粒體泄漏的復(fù)合體Ⅴ(此步可選
做),。
⑤ 步驟④中的沉淀即為線粒體,,加入800uL試劑二和8uL試劑三,超聲波破碎(冰浴,,功率20%或200W,,超聲3s,間隔10秒,重復(fù)30次),,用于復(fù)合體Ⅴ酶活性測定,。
測定步驟:
- 酶促反應(yīng)(在EP管中加入下列試劑)
試劑名稱(μL) | 對照管 | 測定管 |
試劑四 | 20 | 20 |
試劑五 | 80 | 80 |
樣本 |
| 100 |
混勻, 37℃(哺乳動物)或 25℃(其它物種)準(zhǔn)確水浴 30min | ||
試劑六 | 40 | 40 |
樣本 | 100 |
|
混勻,,4000g,,25℃離心 10min,取上清液
- 定磷(在EP管或96孔板中加入下列試劑)
上清液 | 30 | 30 |
定磷試劑 | 170 | 170 |
混勻,,室溫靜置10min后,,在660nm處讀取A測定管和A對照管,計算ΔA=A測定管-A對照管,。每個測定管設(shè)一個對照管,。
復(fù)合體Ⅴ活性計算:
a.使用微量石英比色皿測定的計算公式如下:
標(biāo)準(zhǔn)條件下測定的回歸方程為y= 1.2487x + 0.0361;x為標(biāo)準(zhǔn)品濃度(mmol/L),,y為A 值,。
1、組織中復(fù)合體Ⅴ活性的計算:
(1)按樣本蛋白濃度計算
單位的定義:每mg組織蛋白每分鐘產(chǎn)生1nmol無機磷定義為一個酶活性單位,。
復(fù)合體Ⅴ活性(nmol/min/mg prot)=[(ΔA-0.0361) ÷1.2487×V 反總×106]÷(V樣×Cpr) ÷T=64× (ΔA-0.0361) ÷Cpr
此法需要自行測定樣本蛋白質(zhì)濃度,。
(2)按樣本鮮重計算
單位的定義:每g組織每分鐘產(chǎn)生1nmol無機磷定義為一個酶活性單位。
復(fù)合體Ⅴ活性(nmol/min /g 鮮重)=[(ΔA-0.0361) ÷1.2487×V 反總×106]÷(W×V 樣÷V 樣總)÷T =51.7× (ΔA-0.0361) ÷W
(3)按細菌或細胞密度計算
單位的定義:每1萬個細菌或細胞每分鐘產(chǎn)生1nmol無機磷定義為一個酶活性單位,。
復(fù)合體Ⅴ活性(nmol/min/104cell)=[(ΔA-0.0361) ÷1.2487×V 反總×106]÷(500×V 樣÷V 樣總)÷T=0.103× (ΔA-0.0361)
V 反總:反應(yīng)體系總體積,,2.4×10-4 L; V 樣:加入樣本體積,,0.1 mL,;V 樣總:加入提取液體積,0.808 mL,;T:反應(yīng)時間,,30 min;Cpr:樣本蛋白質(zhì)濃度,,mg/mL;W:樣本質(zhì)量,,g,;500:細胞或細菌總數(shù),500 萬,。
b.使用96孔板測定的計算公式如下:
標(biāo)準(zhǔn)條件下測定的回歸方程為y=0.624x + 0.0361,;x為標(biāo)準(zhǔn)品濃度(mmol/L),y 為A 值,。
1,、組織中復(fù)合體Ⅴ活性的計算:
(1)按樣本蛋白濃度計算
單位的定義:每mg組織蛋白每分鐘產(chǎn)生1nmol無機磷定義為一個酶活性單位。
復(fù)合體Ⅴ活性(nmol/min/mg prot)=[(ΔA-0.0361) ÷0.624×V 反總×106]÷(V 樣×Cpr) ÷T=128× (ΔA-0.0361) ÷Cpr
此法需要自行測定樣本蛋白質(zhì)濃度。
(2)按樣本鮮重計算
單位的定義:每g組織每分鐘產(chǎn)生1nmol無機磷定義為一個酶活性單位,。
復(fù)合體Ⅴ活性(nmol/min/g 鮮重)=[(ΔA-0.0361) ÷0.624×V 反總×106]÷(W×V 樣÷V 樣總) ÷T=103.4× (ΔA-0.0361) ÷W
(3)按細菌或細胞密度計算
單位的定義:每1萬個細菌或細胞每分鐘產(chǎn)生1 nmol無機磷定義為一個酶活性單位,。復(fù)合體Ⅴ活性(nmol/min /104cell)=[(ΔA-0.0361) ÷0.624×V 反總×106]÷(500×V 樣÷V 樣總) ÷T=0.206× (ΔA-0.0361)
V 反總:反應(yīng)體系總體積,2.4×10-4 L,;V 樣:加入樣本體積,,0.1 mL;V 樣總:加入提取液體積,,0.808 mL,;T:反應(yīng)時間,30 min,;Cpr:樣本蛋白質(zhì)濃度,,mg/mL;W:樣本質(zhì)量,,g,;500:細胞或細菌總數(shù),500 萬,。