線粒體復(fù)合體Ⅴ試劑盒說明書
- 公司名稱 上海研謹生物科技有限公司
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- 廠商性質(zhì) 經(jīng)銷商
- 更新時間 2025/1/14 11:27:24
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公司主營： 各種實驗代做：WB代做,，免疫組化,，PCR代做，細胞檢測,，食品安全檢測試劑,，獸藥殘留檢測試劑，動物疫病類檢測,，銷售高品質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)品,，對照品,，ELISA試劑盒，細胞,，血清,，等等
| 供貨周期 | 現(xiàn)貨 | 應(yīng)用領(lǐng)域 | 醫(yī)療衛(wèi)生,環(huán)保,食品,化工,生物產(chǎn)業(yè) |
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貨號：YJ1219 規(guī)格：100管/48樣
線粒體復(fù)合體Ⅴ試劑盒說明書
微量法
正式測定前務(wù)必取2-3個預(yù)期差異較大的樣本做預(yù)測定
測定意義：
線粒體復(fù)合體Ⅴ又稱F1F0-ATP合酶，廣泛存在于動物,、植物,、微生物和培養(yǎng)細胞的線粒體中，由F1和F0兩個亞單位組成,。該酶利用呼吸鏈產(chǎn)生的質(zhì)子電化學(xué)梯度催化ATP合成,，也可逆過程水解ATP。此外,，復(fù)合體Ⅴ還存在于葉綠體,、異養(yǎng)菌和光合細菌中。復(fù)合體Ⅴ是線粒體氧化磷酸化和葉綠體光合磷酸化合成ATP的關(guān)鍵酶,。
測定原理：
復(fù)合體Ⅴ水解ATP產(chǎn)生ADP和Pi,，通過測定Pi增加速率來測定復(fù)合體Ⅴ活性。
需自備的儀器和用品：
可見分光光度計/酶標(biāo)儀,、臺式離心機,、水浴鍋、可調(diào)式移液器,、微量石英比色皿/96 孔板、研缽,、冰和蒸餾水,。
試劑的組成和配制：
試劑一：100mL×1 瓶，-20℃保存,；
試劑二：80mL×1 瓶,，-20℃保存；
試劑三：2mL×1 瓶,，-20℃保存,；
試劑四：粉劑×1 支，-20℃保存,；臨用前加入2mL蒸餾水,，充分溶解備用，用不完的試劑仍-20℃保存;
試劑五：8mL×1 瓶,，4℃保存,；
試劑六：粉劑×1 瓶，4℃保存,；臨用前加入4mL蒸餾水,，充分混勻,；溶解后4℃保存一周；
試劑七：粉劑×1瓶, 4℃保存,；臨用前加入10mL蒸餾水,，充分混勻；溶解后4℃保存一周,；
試劑八：粉劑×1瓶, 4℃保存,；臨用前加入10mL蒸餾水，充分混勻,；溶解后4℃保存一周,；
試劑九：液體 10mL×1 瓶，室溫保存,。
定磷試劑的配制：按H2O: 試劑七:試劑八:試劑九=2:1:1:1 的比例配制,，配好的定磷試劑應(yīng)為淺黃色。若無色則試劑失效,，若是藍色則為磷污染（請根據(jù)需要,，用多少配多少）。
注意：配試劑建議用新的燒杯,、玻棒和玻璃移液器,，或者一次性塑料器皿，以避免磷污染,。
樣本的前處理：
組織,、細菌或細胞中胞漿蛋白與線粒體蛋白的分離：
① 準(zhǔn)確稱取0.1g組織或收集500萬細胞，加入1mL試劑一和10uL試劑三,，用冰浴勻漿器或研缽勻漿,。
② 將勻漿 600g，4℃離心 5min,。
③ 棄沉淀,，將上清液移至另一離心管中，11000g,，4℃離心 10min,。
④ 上清液即為除去線粒體的胞漿蛋白，可用于測定從線粒體泄漏的復(fù)合體Ⅴ（此步可選
做）,。
⑤ 步驟④中的沉淀即為線粒體,，加入800uL試劑二和8uL試劑三，超聲波破碎（冰浴,，功率20％或200W,，超聲3s，間隔10秒，重復(fù)30次）,，用于復(fù)合體Ⅴ酶活性測定,。
測定步驟：
- 酶促反應(yīng)（在EP管中加入下列試劑）
試劑名稱（μL） | 對照管 | 測定管 |
試劑四 | 20 | 20 |
試劑五 | 80 | 80 |
樣本 |
| 100 |
混勻， 37℃（哺乳動物）或 25℃（其它物種）準(zhǔn)確水浴 30min | ||
試劑六 | 40 | 40 |
樣本 | 100 |
|
混勻,，4000g,，25℃離心 10min，取上清液
- 定磷(在EP管或96孔板中加入下列試劑）
上清液 | 30 | 30 |
定磷試劑 | 170 | 170 |
混勻,，室溫靜置10min后,，在660nm處讀取A測定管和A對照管，計算ΔA=A測定管-A對照管,。每個測定管設(shè)一個對照管,。
復(fù)合體Ⅴ活性計算：
a.使用微量石英比色皿測定的計算公式如下：
標(biāo)準(zhǔn)條件下測定的回歸方程為y= 1.2487x + 0.0361；x為標(biāo)準(zhǔn)品濃度（mmol/L）,，y為A 值,。
1、組織中復(fù)合體Ⅴ活性的計算:
（1）按樣本蛋白濃度計算
單位的定義：每mg組織蛋白每分鐘產(chǎn)生1nmol無機磷定義為一個酶活性單位,。
復(fù)合體Ⅴ活性（nmol/min/mg prot）=[(ΔA-0.0361) ÷1.2487×V 反總×106]÷(V樣×Cpr) ÷T=64× (ΔA-0.0361) ÷Cpr
此法需要自行測定樣本蛋白質(zhì)濃度,。
（2）按樣本鮮重計算
單位的定義：每g組織每分鐘產(chǎn)生1nmol無機磷定義為一個酶活性單位。
復(fù)合體Ⅴ活性（nmol/min /g 鮮重）=[(ΔA-0.0361) ÷1.2487×V 反總×106]÷(W×V 樣÷V 樣總)÷T =51.7× (ΔA-0.0361) ÷W
（3）按細菌或細胞密度計算
單位的定義：每1萬個細菌或細胞每分鐘產(chǎn)生1nmol無機磷定義為一個酶活性單位,。
復(fù)合體Ⅴ活性（nmol/min/104cell）=[(ΔA-0.0361) ÷1.2487×V 反總×106]÷(500×V 樣÷V 樣總)÷T=0.103× (ΔA-0.0361)
V 反總：反應(yīng)體系總體積,，2.4×10-4 L； V 樣：加入樣本體積,，0.1 mL,；V 樣總：加入提取液體積，0.808 mL,；T：反應(yīng)時間,，30 min；Cpr：樣本蛋白質(zhì)濃度,，mg/mL；W：樣本質(zhì)量,，g,；500：細胞或細菌總數(shù)，500 萬,。
b.使用96孔板測定的計算公式如下：
標(biāo)準(zhǔn)條件下測定的回歸方程為y=0.624x + 0.0361,；x為標(biāo)準(zhǔn)品濃度（mmol/L），y 為A 值,。
1,、組織中復(fù)合體Ⅴ活性的計算:
（1）按樣本蛋白濃度計算
單位的定義：每mg組織蛋白每分鐘產(chǎn)生1nmol無機磷定義為一個酶活性單位。
復(fù)合體Ⅴ活性（nmol/min/mg prot）=[(ΔA-0.0361) ÷0.624×V 反總×106]÷(V 樣×Cpr) ÷T=128× (ΔA-0.0361) ÷Cpr
此法需要自行測定樣本蛋白質(zhì)濃度。
（2）按樣本鮮重計算
單位的定義：每g組織每分鐘產(chǎn)生1nmol無機磷定義為一個酶活性單位,。
復(fù)合體Ⅴ活性（nmol/min/g 鮮重）=[(ΔA-0.0361) ÷0.624×V 反總×106]÷(W×V 樣÷V 樣總) ÷T=103.4× (ΔA-0.0361) ÷W
（3）按細菌或細胞密度計算
單位的定義：每1萬個細菌或細胞每分鐘產(chǎn)生1 nmol無機磷定義為一個酶活性單位,。復(fù)合體Ⅴ活性（nmol/min /104cell）=[(ΔA-0.0361) ÷0.624×V 反總×106]÷(500×V 樣÷V 樣總) ÷T=0.206× (ΔA-0.0361)
V 反總：反應(yīng)體系總體積，2.4×10-4 L,；V 樣：加入樣本體積,，0.1 mL；V 樣總：加入提取液體積,，0.808 mL,；T：反應(yīng)時間，30 min,；Cpr：樣本蛋白質(zhì)濃度,，mg/mL；W：樣本質(zhì)量,，g,；500：細胞或細菌總數(shù)，500 萬,。
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