貨號：YJ1219                                                規(guī)格：100管/48樣

線粒體復合體Ⅴ試劑盒說明書

微量法

正式測定前務必取2-3個預期差異較大的樣本做預測定

測定意義：

線粒體復合體Ⅴ又稱F₁F₀-ATP合酶,，廣泛存在于動物、植物,、微生物和培養(yǎng)細胞的線粒體中,，由F1和F0兩個亞單位組成。該酶利用呼吸鏈產生的質子電化學梯度催化ATP合成,，也可逆過程水解ATP,。此外，復合體Ⅴ還存在于葉綠體,、異養(yǎng)菌和光合細菌中,。復合體Ⅴ是線粒體氧化磷酸化和葉綠體光合磷酸化合成ATP的關鍵酶。

測定原理：

復合體Ⅴ水解ATP產生ADP和Pi,，通過測定Pi增加速率來測定復合體Ⅴ活性,。

需自備的儀器和用品：

可見分光光度計/酶標儀、臺式離心機,、水浴鍋,、可調式移液器、微量石英比色皿/96 孔板、研缽,、冰和蒸餾水,。

試劑的組成和配制：

試劑一：100mL×1 瓶，-20℃保存,；

試劑二：80mL×1 瓶,，-20℃保存；

試劑三：2mL×1 瓶,，-20℃保存,；

試劑四：粉劑×1 支，-20℃保存,；臨用前加入2mL蒸餾水,，充分溶解備用，用不完的試劑仍-20℃保存;

試劑五：8mL×1 瓶,，4℃保存,；

試劑六：粉劑×1 瓶，4℃保存,；臨用前加入4mL蒸餾水,，充分混勻；溶解后4℃保存一周,；

試劑七：粉劑×1瓶, 4℃保存,；臨用前加入10mL蒸餾水，充分混勻,；溶解后4℃保存一周,；

試劑八：粉劑×1瓶, 4℃保存；臨用前加入10mL蒸餾水,，充分混勻,；溶解后4℃保存一周；

試劑九：液體 10mL×1 瓶,，室溫保存,。

定磷試劑的配制：按H₂O: 試劑七:試劑八:試劑九=2:1:1:1 的比例配制，配好的定磷試劑應為淺黃色,。若無色則試劑失效,，若是藍色則為磷污染（請根據需要，用多少配多少）,。

注意：配試劑建議用新的燒杯,、玻棒和玻璃移液器，或者一次性塑料器皿,，以避免磷污染,。

樣本的前處理：

組織,、細菌或細胞中胞漿蛋白與線粒體蛋白的分離：

① 準確稱取0.1g組織或收集500萬細胞，加入1mL試劑一和10uL試劑三,，用冰浴勻漿器或研缽勻漿,。

② 將勻漿 600g，4℃離心 5min,。

③ 棄沉淀,，將上清液移至另一離心管中,，11000g,，4℃離心 10min。

④ 上清液即為除去線粒體的胞漿蛋白,，可用于測定從線粒體泄漏的復合體Ⅴ（此步可選

做）,。

⑤ 步驟④中的沉淀即為線粒體，加入800uL試劑二和8uL試劑三,，超聲波破碎（冰浴,，功率20％或200W，超聲3s,，間隔10秒,，重復30次），用于復合體Ⅴ酶活性測定,。

測定步驟：

• 酶促反應（在EP管中加入下列試劑）

混勻，4000g,，25℃離心 10min,，取上清液

• 定磷(在EP管或96孔板中加入下列試劑）

混勻，室溫靜置10min后,，在660nm處讀取A測定管和A對照管,，計算ΔA=A測定管-A對照管。每個測定管設一個對照管,。

復合體Ⅴ活性計算：

a.使用微量石英比色皿測定的計算公式如下：

標準條件下測定的回歸方程為y= 1.2487x + 0.0361,；x為標準品濃度（mmol/L），y為A 值,。

1,、組織中復合體Ⅴ活性的計算:

（1）按樣本蛋白濃度計算

單位的定義：每mg組織蛋白每分鐘產生1nmol無機磷定義為一個酶活性單位。

復合體Ⅴ活性（nmol/min/mg prot）=[(ΔA-0.0361) ÷1.2487×V 反總×10⁶]÷(V樣×Cpr) ÷T=64× (ΔA-0.0361) ÷Cpr

此法需要自行測定樣本蛋白質濃度,。

（2）按樣本鮮重計算

單位的定義：每g組織每分鐘產生1nmol無機磷定義為一個酶活性單位,。

復合體Ⅴ活性（nmol/min /g 鮮重）=[(ΔA-0.0361) ÷1.2487×V 反總×10⁶]÷(W×V 樣÷V 樣總)÷T =51.7× (ΔA-0.0361) ÷W

（3）按細菌或細胞密度計算

單位的定義：每1萬個細菌或細胞每分鐘產生1nmol無機磷定義為一個酶活性單位。

復合體Ⅴ活性（nmol/min/10⁴cell）=[(ΔA-0.0361) ÷1.2487×V 反總×10⁶]÷(500×V 樣÷V 樣總)÷T=0.103× (ΔA-0.0361)

V 反總：反應體系總體積,，2.4×10^-4 L,； V 樣：加入樣本體積,，0.1 mL；V 樣總：加入提取液體積,，0.808 mL,；T：反應時間，30 min,；Cpr：樣本蛋白質濃度,，mg/mL；W：樣本質量,，g,；500：細胞或細菌總數，500 萬,。

b.使用96孔板測定的計算公式如下：

標準條件下測定的回歸方程為y=0.624x + 0.0361,；x為標準品濃度（mmol/L），y 為A 值,。

1,、組織中復合體Ⅴ活性的計算:

（1）按樣本蛋白濃度計算

單位的定義：每mg組織蛋白每分鐘產生1nmol無機磷定義為一個酶活性單位。

復合體Ⅴ活性（nmol/min/mg prot）=[(ΔA-0.0361) ÷0.624×V 反總×10⁶]÷(V 樣×Cpr) ÷T=128× (ΔA-0.0361) ÷Cpr

此法需要自行測定樣本蛋白質濃度,。

（2）按樣本鮮重計算

單位的定義：每g組織每分鐘產生1nmol無機磷定義為一個酶活性單位,。

復合體Ⅴ活性（nmol/min/g 鮮重）=[(ΔA-0.0361) ÷0.624×V 反總×10⁶]÷(W×V 樣÷V 樣總) ÷T=103.4× (ΔA-0.0361) ÷W

（3）按細菌或細胞密度計算

單位的定義：每1萬個細菌或細胞每分鐘產生1 nmol無機磷定義為一個酶活性單位。復合體Ⅴ活性（nmol/min /10⁴cell）=[(ΔA-0.0361) ÷0.624×V 反總×10⁶]÷(500×V 樣÷V 樣總) ÷T=0.206× (ΔA-0.0361)

V 反總：反應體系總體積,，2.4×10^-4 L,；V 樣：加入樣本體積，0.1 mL,；V 樣總：加入提取液體積,，0.808 mL；T：反應時間,，30 min,；Cpr：樣本蛋白質濃度，mg/mL,；W：樣本質量,，g；500：細胞或細菌總數,，500 萬,。

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