貨號:YJ2445                                                    規(guī)格：25管/24樣

線粒體復合體Ⅱ試劑盒說明書

可見分光光度法

正式測定前務必取 2-3個預期差異較大的樣本做預測定

測定意義

線粒體復合體Ⅱ又稱琥珀酸-輔酶Q還原酶，廣泛存在于動物,、植物,、微生物和培養(yǎng)細胞的線粒體中，催化琥珀酸氧化生成延胡索酸,，同時輔基 FAD 還原為 FADH₂,，后者進一步還原氧化型輔酶Q生成還原型輔酶Q，是呼吸電子傳遞鏈的支路,。

測定原理

復合體Ⅱ的催化產(chǎn)物還原型輔酶Q可進一步還原2,6-二氯吲哚酚,，2,6-二氯吲哚酚在605nm 有特征吸收峰，通過檢測2,6-二氯吲哚酚的減少速率來計算該酶活性,。

需自備的儀器和用品

可見分光光度計,、臺式離心機、水浴鍋,、可調(diào)式移液器,、1mL 玻璃比色皿、研缽,、冰和蒸餾水,。

試劑組成和配制

試劑一：25mL×1 瓶，-20℃保存,；

試劑二：5mL×1 瓶,，-20℃保存；

試劑三：0.5 mL×1 支,，-20℃保存,；

試劑四：液體 25mL×1 瓶，4℃保存,；

試劑五：粉劑×1 支,，-20℃保存；

試劑六：粉劑×1 支,，-20℃保存,；

試劑七：液體 2.5mL×1 瓶，4℃保存,；

樣本的前處理：

組織,、細菌或細胞中胞漿蛋白與線粒體蛋白的分離：

1、 準確稱取 0.1g 組織或收集 500 萬細菌或細胞,，加入 1mL 試劑一和 10uL 試劑三,，用冰浴勻漿器或研缽勻漿。

2、 將勻漿 600g,，4℃離心 5min,。

3、 棄沉淀,，將上清液移至另一離心管中,，11000g，4℃離心 10min,。

4,、 上清液即為除去線粒體的胞漿蛋白，可用于測定從線粒體泄漏的復合體Ⅱ（此步可選

做）,。

5,、 步驟④中的沉淀即為線粒體，加入200uL試劑二和2uL試劑三,，超聲波破碎（冰浴，功率 20％或 200W,，超聲3s,，間隔10秒，重復30次）,，用于復合體Ⅱ酶活性測定,。

測定步驟：

1、 分光光度計預熱30min以上,，調(diào)節(jié)波長至605nm,，蒸餾水調(diào)零。

2,、 樣本測定

（1）工作液的配制：臨用前把試劑五和試劑六轉(zhuǎn)移到試劑四中混合溶解,，置于37℃（哺乳

動物）或25℃（其它物種）孵育5min；用不完的試劑 4℃可保存一周,；

（2）在1mL 玻璃比色皿中加入40μL樣本,、100μL試劑七和800μL工作液，立即混勻,，記錄 605nm處初始吸光值A(chǔ)1和2min后的吸光值A(chǔ)2,，計算 ΔA=A1-A2。

復合體Ⅱ活力單位的計算

（1） 按樣本蛋白濃度計算

單位的定義：每 mg 組織蛋白每分鐘消耗 1 nmol 2,6-二氯吲哚酚定義為一個酶活力單位,。

復合體Ⅱ活力(nmol/min/mg prot)=[ΔA×V反總÷（ε×d）×10⁹]÷(V樣×Cpr) ÷T

=559×ΔA÷Cpr

此法需要自行測定樣本蛋白質(zhì)濃度,。

（2） 按樣本鮮重計算

單位的定義：每g組織每分鐘消耗1nmol 2,6-二氯吲哚酚定義為一個酶活力單位。

復合體Ⅱ活力(nmol/min/g 鮮重)=[ΔA×V反總÷（ε×d）×10⁹]÷(W×V樣÷V樣總)÷T=113×ΔA÷W

（3） 按細菌或細胞密度計算

單位的定義：每1萬個細菌或細胞每分鐘消耗1 nmol 2,6-二氯吲哚酚定義為一個酶活力單位,。

復合體Ⅱ活力(nmol/min/10⁴cell)=[ΔA×V反總÷（ε×d）×10⁹]÷(500×V樣÷V樣總) ÷T=0.226×ΔA

V 反總：反應體系總體積,，9.4×10^-4 L；ε：2,6-二氯吲哚酚摩爾消光系數(shù)，2.1×10⁴L/mol /cm,；

d：比色皿光徑,，1cm；V 樣：加入樣本體積,，0.04 mL,；V 樣總：加入提取液體積，0.202 mL,；

T：反應時間,，2 min；Cpr：樣本蛋白質(zhì)濃度,，mg/mL,；W：樣本質(zhì)量，g,；500：細胞或細

菌總數(shù),，500 萬。

線粒體復合體ⅱ試劑盒說明書（微量法）