貨號(hào):YJ2445                                                    規(guī)格：25管/24樣

線粒體復(fù)合體Ⅱ試劑盒說明書

可見分光光度法

正式測(cè)定前務(wù)必取 2-3個(gè)預(yù)期差異較大的樣本做預(yù)測(cè)定

測(cè)定意義

線粒體復(fù)合體Ⅱ又稱琥珀酸-輔酶Q還原酶,，廣泛存在于動(dòng)物、植物,、微生物和培養(yǎng)細(xì)胞的線粒體中,，催化琥珀酸氧化生成延胡索酸，同時(shí)輔基 FAD 還原為 FADH₂,，后者進(jìn)一步還原氧化型輔酶Q生成還原型輔酶Q,，是呼吸電子傳遞鏈的支路。

測(cè)定原理

復(fù)合體Ⅱ的催化產(chǎn)物還原型輔酶Q可進(jìn)一步還原2,6-二氯吲哚酚,，2,6-二氯吲哚酚在605nm 有特征吸收峰,，通過檢測(cè)2,6-二氯吲哚酚的減少速率來計(jì)算該酶活性。

需自備的儀器和用品

可見分光光度計(jì),、臺(tái)式離心機(jī),、水浴鍋、可調(diào)式移液器,、1mL 玻璃比色皿,、研缽、冰和蒸餾水,。

試劑組成和配制

試劑一：25mL×1 瓶,，-20℃保存；

試劑二：5mL×1 瓶,，-20℃保存,；

試劑三：0.5 mL×1 支，-20℃保存；

試劑四：液體 25mL×1 瓶,，4℃保存,；

試劑五：粉劑×1 支，-20℃保存,；

試劑六：粉劑×1 支,，-20℃保存；

試劑七：液體 2.5mL×1 瓶,，4℃保存,；

樣本的前處理：

組織、細(xì)菌或細(xì)胞中胞漿蛋白與線粒體蛋白的分離：

1,、 準(zhǔn)確稱取 0.1g 組織或收集 500 萬細(xì)菌或細(xì)胞,，加入 1mL 試劑一和 10uL 試劑三，用冰浴勻漿器或研缽勻漿,。

2,、 將勻漿 600g，4℃離心 5min,。

3,、 棄沉淀，將上清液移至另一離心管中,，11000g,，4℃離心 10min。

4,、 上清液即為除去線粒體的胞漿蛋白,，可用于測(cè)定從線粒體泄漏的復(fù)合體Ⅱ（此步可選

做）,。

5,、 步驟④中的沉淀即為線粒體，加入200uL試劑二和2uL試劑三,，超聲波破碎（冰浴,，功率 20％或 200W，超聲3s,，間隔10秒,，重復(fù)30次），用于復(fù)合體Ⅱ酶活性測(cè)定,。

測(cè)定步驟：

1,、 分光光度計(jì)預(yù)熱30min以上，調(diào)節(jié)波長(zhǎng)至605nm,，蒸餾水調(diào)零,。

2、 樣本測(cè)定

（1）工作液的配制：臨用前把試劑五和試劑六轉(zhuǎn)移到試劑四中混合溶解,，置于37℃（哺乳

動(dòng)物）或25℃（其它物種）孵育5min,；用不完的試劑 4℃可保存一周,；

（2）在1mL 玻璃比色皿中加入40μL樣本、100μL試劑七和800μL工作液,，立即混勻,，記錄 605nm處初始吸光值A(chǔ)1和2min后的吸光值A(chǔ)2，計(jì)算 ΔA=A1-A2,。

復(fù)合體Ⅱ活力單位的計(jì)算

（1） 按樣本蛋白濃度計(jì)算

單位的定義：每 mg 組織蛋白每分鐘消耗 1 nmol 2,6-二氯吲哚酚定義為一個(gè)酶活力單位,。

復(fù)合體Ⅱ活力(nmol/min/mg prot)=[ΔA×V反總÷（ε×d）×10⁹]÷(V樣×Cpr) ÷T

=559×ΔA÷Cpr

此法需要自行測(cè)定樣本蛋白質(zhì)濃度。

（2） 按樣本鮮重計(jì)算

單位的定義：每g組織每分鐘消耗1nmol 2,6-二氯吲哚酚定義為一個(gè)酶活力單位,。

復(fù)合體Ⅱ活力(nmol/min/g 鮮重)=[ΔA×V反總÷（ε×d）×10⁹]÷(W×V樣÷V樣總)÷T=113×ΔA÷W

（3） 按細(xì)菌或細(xì)胞密度計(jì)算

單位的定義：每1萬個(gè)細(xì)菌或細(xì)胞每分鐘消耗1 nmol 2,6-二氯吲哚酚定義為一個(gè)酶活力單位,。

復(fù)合體Ⅱ活力(nmol/min/10⁴cell)=[ΔA×V反總÷（ε×d）×10⁹]÷(500×V樣÷V樣總) ÷T=0.226×ΔA

V 反總：反應(yīng)體系總體積，9.4×10^-4 L,；ε：2,6-二氯吲哚酚摩爾消光系數(shù),，2.1×10⁴L/mol /cm；

d：比色皿光徑,，1cm,；V 樣：加入樣本體積，0.04 mL,；V 樣總：加入提取液體積,，0.202 mL；

T：反應(yīng)時(shí)間,，2 min,；Cpr：樣本蛋白質(zhì)濃度，mg/mL,；W：樣本質(zhì)量,，g；500：細(xì)胞或細(xì)

菌總數(shù),，500 萬,。

線粒體復(fù)合體ⅱ試劑盒說明書（微量法）