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LH 促黃體生成素(LH)ELISA 試劑盒

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促黃體生成素LHELISA試劑盒測試盒

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捕獲法

血清中針對某些抗原的特異性IgM常和特異性IgG同時存在,,后者會干擾IgM抗體的測定。因此測定IgM抗體多用捕獲法,,先將所有血清IgM(包括異性IgM和非特異性IgM)固定在固相上,,在去除IgG后再測定特異性IgM。操作步驟如下:

⑴將抗人IgM抗體連接在固相載體上,,形成固相抗人IgM,。洗滌。

⑵加入稀釋的血清標(biāo)本:保溫反應(yīng)后血清中的IgM抗體被固相抗體捕獲,。洗滌除去其他免疫球蛋白和血清中的雜質(zhì)成分,。

⑶加入特異性抗原試劑:它只與固相上的特異性IgM結(jié)合。洗滌,。

⑷加入針對特異性的酶標(biāo)抗體:使之與結(jié)合在固相上的抗原反應(yīng)結(jié)合,。洗滌。

⑸加底物顯色:如有顏色顯示,,則表示血清標(biāo)本中的特異性IgM抗體存在,,是為陽性反應(yīng)。 

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定量測定

ELISA操作步驟復(fù)雜,,影響反應(yīng)因素較多,,特別是固相載體的包被難達到各個體之間的*,,因此在定量測定中,每批測試均須用一系列不同濃度的參考標(biāo)準(zhǔn)品在相同的條件下制作標(biāo)準(zhǔn)曲線,。測定大分子量物質(zhì)的夾心法ELISA,,標(biāo)準(zhǔn)曲線的范圍一般較寬,曲線高點的吸光度可接近2.0,,繪制時常用半對數(shù)值,,以檢測物的濃度為橫坐標(biāo),以吸光度為縱坐標(biāo),,將各濃度的值逐點連接,,所得曲線一般呈S形,其頭,、尾部曲線趨于平坦,,中央較呈直線的部分是理想的檢測區(qū)域。

測定小分子量物質(zhì)常用競爭法,,其標(biāo)準(zhǔn)曲線中吸光度與受檢物質(zhì)的濃度呈負相關(guān),。標(biāo)準(zhǔn)曲線的形狀因試劑盒所用模式的差別而略有不同。ELISA測定的標(biāo)準(zhǔn)曲線注意圖中橫坐標(biāo)為對數(shù)關(guān)系,,這更有利于測定系統(tǒng)的表達,。

操作程序

1.   分別設(shè)空白孔(空白對照孔不加樣品及酶標(biāo)試劑,其余各步操作相同),、標(biāo)準(zhǔn)品孔,、待測樣品孔。在酶標(biāo)包被板上標(biāo)準(zhǔn)品孔中加入標(biāo)準(zhǔn)品50μl,;在酶標(biāo)包被板上待測樣品孔中先加樣品稀釋液40μl,,然后再加待測樣品10μl(樣品zui終稀釋度為5倍)。每孔加入酶標(biāo)試劑50μl,,空白孔除外,。輕輕晃動混勻,37℃溫育60分鐘,。

2.   棄去液體,,甩干,每孔加滿稀釋后洗滌液,,振蕩30秒,,甩去洗滌液,用吸水紙拍干,。如此重復(fù)5次,,拍干。

3.   每孔先加入顯色劑A50μl,,再加入顯色劑B50μl,,輕輕震蕩混勻,,37℃避光顯色15分鐘.

4.   取出酶標(biāo)板,每孔加終止液50μl,,終止反應(yīng)(此時藍色立轉(zhuǎn)黃色),。

5.   測定:以空白孔調(diào)零,在450nm波長下測量各孔的吸光度值(OD值),。 測定應(yīng)在加終止液后15分鐘以內(nèi)進行。

6.   根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)品的濃度及對應(yīng)的OD值計算出標(biāo)準(zhǔn)曲線的直線回歸方程,,再根據(jù)樣品的OD值在回歸方程上計算出對應(yīng)的樣品濃度,。也可以使用各種應(yīng)用軟件來計算。應(yīng)記住由于樣品稀釋了的,,其實際濃度應(yīng)該乘以總稀釋倍數(shù),。



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