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內(nèi)脂素（VF）ELISA 試劑盒

用于標(biāo)記抗體或抗抗體的酶須具有下列特性：有高度的活性和敏感性,；在室溫下穩(wěn)定；反應(yīng)產(chǎn)物易于顯現(xiàn),；能商品化生產(chǎn),。當(dāng)前應(yīng)用較多的有辣根過氧化物酶（HRP）、堿性磷酸酶,、葡萄糖氧化酶等,，其中以HRP應(yīng)用廣。 

過氧化物酶

過氧化物酶廣泛分布于植物中，辣根中含量高,，從辣根中提取的稱辣根過氧化物酶（HRP）,，是由無色酶蛋白和深棕色的鐵卟啉構(gòu)成的一種糖蛋白（含糖量18%），分子量約40 000,，約由300個氨基酸組成,，等電點為pH 3-9，催化反應(yīng)的適pH值因供氫體不同而稍有差異,，一般多在pH 5左右,。此酶溶于水和50%飽和度以下的硫酸銨溶液。酶蛋白和輔基的大吸收光譜分別為275nm和403nm,。

酶的純度以RZ表示：RZ=OD403/OD275

純酶的RZ多在3.0以上,，高為3.4。RZ在0.6以下的酶制品為粗酶,，非酶蛋白約占 75%,，不能用于標(biāo)記。RZ在2.5以上者方可用于標(biāo)記,。HRP的作用底物為過氧化氫,，催化反應(yīng)時的供氫體有幾種：（1）鄰苯二胺（OPD），產(chǎn)物為橙色,，可溶性,，敏感性高，大吸收值在490nm,，可用肉眼觀察判別,，容易被濃H2SO4終止反應(yīng)，顏色可在數(shù)小時內(nèi)不改變,是目前國內(nèi)ELISA中常用的一種,；（2）聯(lián)大茴香胺（OD）,產(chǎn)物為橘黃色,，大吸收值在400nm，顏色較穩(wěn)定,；（3）5－氨基水楊酸（5－AS）：產(chǎn)物為深棕色,，大吸收值在449nm，部分溶解,，敏感性較差,；（4）鄰聯(lián)甲苯胺（OT）產(chǎn)物為藍(lán)色，大吸收值在630nm,，部分溶解,，不穩(wěn)定，不耐酸,，但反應(yīng)快,，顏色明顯。

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定性測定
　　　定性測定的結(jié)果判斷是對受檢標(biāo)本中是否含有待測抗原或抗體作出"有"或"無"的簡單回答，分別用"陽性",、"陰性"表示,。"陽性"表示該標(biāo)本在該測定系統(tǒng)中有反應(yīng)。"陰性"則為無反應(yīng),。用定性判斷法也可得到半定量結(jié)果,，即用滴度來表示反應(yīng)的強(qiáng)度，其實質(zhì)仍是一個定性試驗,。在這種半定量測定中,，將標(biāo)本作一系列稀釋后進(jìn)行試驗，呈陽性反應(yīng)的高稀釋度即為滴度,。根據(jù)滴度的高低,，可以判斷標(biāo)本反應(yīng)性的強(qiáng)弱，這比觀察不稀釋標(biāo)本呈色的深淺判斷為強(qiáng)陽性,、弱陽性更具定量意義,。

在間接法和夾心法ELISA中，陽性孔呈色深于陰性孔,。在競爭法ELISA中則相反,，陰性孔呈色深于陽性孔。

操作程序

1.   分別設(shè)空白孔（空白對照孔不加樣品及酶標(biāo)試劑,，其余各步操作相同）、標(biāo)準(zhǔn)品孔,、待測樣品孔,。在酶標(biāo)包被板上標(biāo)準(zhǔn)品孔中加入標(biāo)準(zhǔn)品50μl；在酶標(biāo)包被板上待測樣品孔中先加樣品稀釋液40μl,，然后再加待測樣品10μl（樣品zui終稀釋度為5倍）,。每孔加入酶標(biāo)試劑50μl，空白孔除外,。輕輕晃動混勻,，37℃溫育60分鐘。

2.   棄去液體,，甩干,，每孔加滿稀釋后洗滌液，振蕩30秒,，甩去洗滌液,，用吸水紙拍干。如此重復(fù)5次,，拍干,。

3.   每孔先加入顯色劑A50μl，再加入顯色劑B50μl，輕輕震蕩混勻,，37℃避光顯色15分鐘.

4.   取出酶標(biāo)板,，每孔加終止液50μl，終止反應(yīng)（此時藍(lán)色立轉(zhuǎn)黃色）,。

5.   測定：以空白孔調(diào)零,，在450nm波長下測量各孔的吸光度值（OD值）。 測定應(yīng)在加終止液后15分鐘以內(nèi)進(jìn)行,。

6.   根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)品的濃度及對應(yīng)的OD值計算出標(biāo)準(zhǔn)曲線的直線回歸方程,，再根據(jù)樣品的OD值在回歸方程上計算出對應(yīng)的樣品濃度。也可以使用各種應(yīng)用軟件來計算,。應(yīng)記住由于樣品稀釋了的,，其實際濃度應(yīng)該乘以總稀釋倍數(shù)。