三,、預(yù)期用途  豬傳染性胸膜肺炎是由胸膜肺炎放線桿菌（Actinomycetes Pleuropneumonia,，APP）引起的一種高度傳染性呼吸道疾病，以急性出血性纖維素性胸膜肺炎和慢性纖維素性壞死性胸膜肺炎為特征,。APPzui主要的毒力因子為Apx毒素,，其中ApxⅣA毒素在所有血清型中都存在。

   本試劑盒檢測豬血清,、血漿樣品中ApxⅣ特異性抗體,，可用于胸膜肺炎放線桿菌野毒感染的診斷。

四,、試劑盒原理

   本試劑盒系由預(yù)包被胸膜肺炎放線桿菌（APP）抗原的酶標(biāo)板,、酶標(biāo)記物及其他配套試劑組成，應(yīng)用酶聯(lián)免疫法（ELISA）原理檢測豬血清,、血漿樣品中胸膜肺炎放線桿菌ApxⅣA抗體,。實驗時在酶標(biāo)板孔中加入待檢樣品，經(jīng)溫育后若樣品中含有胸膜肺炎放線桿菌ApxⅣA抗體,，則與酶標(biāo)板上抗原結(jié)合,；經(jīng)洗滌除去未結(jié)合的其他成分后加入酶標(biāo)記物，與酶標(biāo)板上抗原抗體復(fù)合物發(fā)生特異性結(jié)合,；再經(jīng)洗滌除去未結(jié)合的酶標(biāo)記物,，加入底物液A、B,，與酶反應(yīng)形成藍(lán)色產(chǎn)物,，顯色深淺與樣品中的特異性抗體含量成正相關(guān)；加入終止液終止反應(yīng)后產(chǎn)物變?yōu)辄S色,；用酶標(biāo)儀在450nm波長測定各反應(yīng)孔中的吸光值,，即可知樣品是否含有胸膜肺炎放線桿菌ApxⅣA抗體。

五,、試劑盒組成

酶標(biāo)板,、酶標(biāo)記物、樣品稀釋液,、濃縮洗滌液,、底物液A、底物液B,、陽性對照,、陰性對照

六、儲存及有效期

于2～8℃避光保存,，有效期為12個月,。

包被板開封后請于2～8℃避光保存,，避免受潮。使用期限為2個月,。

七,、適用儀器   含450nm、630nm波長的酶標(biāo)儀,，37℃恒溫設(shè)備,，可調(diào)微量移液器。

操作步驟

一,、樣品準(zhǔn)備

1.取動物全血按常規(guī)方法制備血清,，要求血清清亮，無溶血,、無污染,。樣品1周內(nèi)可于2～8℃保存，*需置-20℃保存,。

2.用樣品稀釋液將待檢血清按40倍稀釋（如5μl血清加入195μl樣品稀釋液中,，混勻）。陰,、陽性對照不用稀釋,。

3.濃縮洗滌液使用前應(yīng)恢復(fù)至室溫使沉淀溶解，然后用蒸餾水或去離子水作20倍稀釋,。

二,、檢驗方法

1.使用前將試劑盒置室溫30分鐘，恢復(fù)至室溫,。

2.取所需用量酶標(biāo)板條,，設(shè)空白對照1孔、陰性/陽性對照各2孔,，未用的板條盡快密封,，2～8℃保存。

3.空白對照孔加樣品稀釋液100μl,；陰,、陽性對照孔分別加入陰、陽性對照100μl,；樣品孔每孔加入稀釋后的樣品100μl,。

4.混勻，置37℃反應(yīng)30分鐘,。

5.扣去孔內(nèi)液體,，每孔加滿洗滌液,，靜置30秒后棄去,，重復(fù)洗滌5次,，拍干。

6.每孔加酶標(biāo)記物100μl（空白孔除外）,。置37℃反應(yīng)30分鐘,。

7.洗滌，同步驟5,。

8.每孔依次加底物液A,、底物液B各50μl，混勻,，37℃避光反應(yīng)10分鐘,。

9.每孔加終止液50μl，混勻,，用空白孔調(diào)零,，于450nm(可用630nm作參比波長）測定各孔吸光值（A值）。

結(jié)果分析

一,、參考值

實驗正常的情況下,，陰性對照≤0.10，陽性對照≥0.6,。

二,、檢驗結(jié)果的解釋

1.樣品A值≥0.38為陽性；樣品A值在0.2到0.38之間為可疑,；樣品A值＜0.2為陰性,。

2.本實驗結(jié)果為陰性或可疑時表明豬只抗體水平不足，建議補(bǔ)打相應(yīng)疫苗,。