一,、背景

小鼠巨噬細(xì)胞是一種存在于小鼠體內(nèi)的免疫細(xì)胞,，也稱為巨噬細(xì)胞系,。巨噬細(xì)胞是一種多能性干細(xì)胞,，可以分化為多種類型的細(xì)胞，包括樹突狀細(xì)胞、粒細(xì)胞和單核細(xì)胞等,。

小鼠巨噬細(xì)胞在免疫系統(tǒng)中起著重要的作用,。它們可以吞噬和消化細(xì)菌、病毒和其他微生物,，從而保護(hù)機(jī)體免受感染,。此外，巨噬細(xì)胞還可以分泌多種細(xì)胞因子和趨化因子,，調(diào)節(jié)免疫反應(yīng)的發(fā)生和發(fā)展,。

在醫(yī)學(xué)研究中，小鼠巨噬細(xì)胞被廣泛用于研究免疫系統(tǒng)的功能和疾病機(jī)制,。例如,，通過將特定的基因?qū)胄∈缶奘杉?xì)胞中，可以研究這些基因?qū)γ庖呦到y(tǒng)的影響,。此外,，由于小鼠和人類的免疫系統(tǒng)存在一定的相似性，因此小鼠巨噬細(xì)胞也被用于研究人類免疫相關(guān)疾病的發(fā)病機(jī)制和治療方法,。

二,、小鼠巨噬細(xì)胞培養(yǎng)操作

1)復(fù)蘇小鼠巨噬細(xì)胞：以下細(xì)胞培養(yǎng)凍存處理僅供參考，具體操作步驟以隨貨產(chǎn)品說明書為主,。

將含有1 mL細(xì)胞懸液的凍存管在37℃水浴中迅速搖晃解凍,，加4 mL培養(yǎng)基混合均勻。在1000 rpm條件下離心3 min,，棄去上清液,，加1-2 mL培養(yǎng)基后吹勻。然后將所有細(xì)胞懸液加入含適量培養(yǎng)基的培養(yǎng)瓶中培養(yǎng)過夜（或?qū)⒓?xì)胞懸液加入10 cm皿中,，加入約8 mL培養(yǎng)基,，培養(yǎng)過夜）,。第二天換液并檢查細(xì)胞密度,。

2)小鼠巨噬細(xì)胞傳代：如果細(xì)胞密度達(dá)80%-90%，即可進(jìn)行傳代培養(yǎng),。

a,、棄去培養(yǎng)上清，用不含鈣,、鎂離子的PBS潤(rùn)洗細(xì)胞1-2次,。

b、加1 mL消化液（0.25%Trypsin-0.53mM EDTA）于培養(yǎng)瓶中,，使消化液浸潤(rùn)所有細(xì)胞,，棄去消化液，將培養(yǎng)瓶置于37℃培養(yǎng)箱中消化1 min,，然后在顯微鏡下觀察細(xì)胞消化情況,，若細(xì)胞大部分變圓并脫落,，迅速拿回操作臺(tái)，輕敲幾下培養(yǎng)瓶后加少量培養(yǎng)基終止消化,。

c,、按6-8 mL/瓶補(bǔ)加培養(yǎng)基，輕輕打勻后裝入無菌離心管中,，1000 rpm離心4 min,，棄去上清液，補(bǔ)加1-2 mL培養(yǎng)液后吹勻,。

d,、將細(xì)胞懸液按1:2比例分到新的含8 mL培養(yǎng)基的新皿中或者瓶中，置于培養(yǎng)箱中培養(yǎng),。

3)小鼠巨噬細(xì)胞凍存：待細(xì)胞生長(zhǎng)狀態(tài)良好時(shí),，可進(jìn)行細(xì)胞凍存。

下面T25瓶為例,；

a,、收集細(xì)胞及細(xì)胞培養(yǎng)液，裝入無菌離心管中,，1000 rpm條件下離心4 min,，棄去上清液，用PBS清洗一遍,，棄盡PBS,，進(jìn)行細(xì)胞計(jì)數(shù)。

b,、根據(jù)細(xì)胞數(shù)量加入無血清細(xì)胞凍存液,，使細(xì)胞密度5×106~1×107/mL，輕輕混勻,，每支凍存管凍存1mL細(xì)胞懸液,，注意凍存管做好標(biāo)識(shí)。

c,、將凍存管放入-80℃冰箱,，24 h后轉(zhuǎn)入液氮灌儲(chǔ)存。記錄凍存管位置以便下次拿取,。

三,、應(yīng)用

小鼠巨噬細(xì)胞可以用于賈第蟲胞外囊泡激活小鼠巨噬細(xì)胞NLRP3炎性小體的分子機(jī)制：

分離鑒定賈第蟲胞外囊泡(GEVs),從GEVs誘導(dǎo)小鼠巨噬細(xì)胞細(xì)胞炎性應(yīng)答角度研究,分析參與這一過程的關(guān)鍵炎性小體及其激活的分子機(jī)制;并分析GEVs中的蛋白質(zhì)組份信息,確定激活NLRP3炎性小體的單分子;最后通過動(dòng)物試驗(yàn),確定GEVs關(guān)鍵分子介導(dǎo)的NLRP3炎性小體激活對(duì)蟲體感染的影響,進(jìn)一步揭示其在賈第蟲致病中的作用。

1) GEVs刺激小鼠巨噬細(xì)胞模型建立,。超速離心富集賈第蟲滋養(yǎng)體分泌的GEVs,透射電鏡下呈典型“杯狀”結(jié)構(gòu),粒徑大小為150 nm;激光共聚焦觀察GEVs能夠被宿主細(xì)胞主動(dòng)吞噬進(jìn)入胞內(nèi),并呈現(xiàn)時(shí)間依賴性;熒光定量PCR和ELISA實(shí)驗(yàn)測(cè)定GEVs能夠激活小鼠腹腔巨噬細(xì)胞炎性應(yīng)答,并引起多種炎性細(xì)胞因子和趨化因子轉(zhuǎn)錄及分泌水平升高,且呈現(xiàn)劑量依賴性,。結(jié)果表明賈第蟲能夠分泌GEVs,且可以進(jìn)入宿主細(xì)胞內(nèi)激活宿主細(xì)胞炎性應(yīng)答。

2) 2)GEVs激活宿主小鼠巨噬細(xì)胞PRRs分子類型鑒定。GEVs刺激小鼠腹腔巨噬細(xì)胞后引起多種NLRs和TLRs轉(zhuǎn)錄水平升高,其中NLRP3和TLR2升高顯著;GEVs刺激使NLRP3受體呈現(xiàn)點(diǎn)狀激活并聚集于細(xì)胞核周圍,、TLR2受體大量表達(dá)于細(xì)胞膜上;通過鉀離子外流和溶酶體損傷途徑阻斷NLRP3受體和阻斷TLR2受體均可以顯著下調(diào)多種炎性細(xì)胞因子和趨化因子轉(zhuǎn)錄水平,、多種炎性細(xì)胞因子分泌水平和IL-1βp17蛋白表達(dá)水平。結(jié)果表明GEVs通過激活宿主TLR2和NLRP3信號(hào)通路調(diào)控宿主巨噬細(xì)胞炎性應(yīng)答,。

3) GEVs激活小鼠巨噬細(xì)胞炎性小體第二信號(hào)的研究,。GEVs刺激小鼠腹腔巨噬細(xì)胞引起NLRP3炎性小體關(guān)鍵蛋白基因轉(zhuǎn)錄水平升高,在感染后6 h～24 h范圍內(nèi)caspase-1 p20的活化和IL-1βp17的分泌呈現(xiàn)先升高到12 h達(dá)到峰值然后降低的趨勢(shì),在12.5μg～25μg范圍內(nèi)caspase-1 p20的活化和IL-1βp17的分泌呈現(xiàn)劑量依賴性升高;通過阻斷鉀離子外流途徑、溶酶體損傷途徑,、caspase-1活化途徑,、泛caspase-1激活途徑阻斷NLRP3炎性小體激活,可以不同程度下調(diào)IL-1β的基因轉(zhuǎn)錄、蛋白分泌和表達(dá),且溶酶體損傷途徑和泛caspase-1途徑更為顯著;阻斷IL-1β后能夠顯著下調(diào)其它炎性細(xì)胞因子IL-6和TNF-α的轉(zhuǎn)錄和分泌水平,。結(jié)果表明GEVs能夠通過溶酶體損傷途徑激活宿主NLRP3炎性小體,調(diào)控IL-1βp17的分泌并介導(dǎo)宿主炎性應(yīng)答,。

4)GEVs激活小鼠巨噬細(xì)胞炎性小體信號(hào)的研究。GEVs刺激小鼠腹腔巨噬細(xì)胞和THP-1細(xì)胞均能促進(jìn)賈第蟲介導(dǎo)的NLRP3炎性小體信號(hào)pro-IL-1β和其它炎性因子IL-6/TNF-α的轉(zhuǎn)錄和分泌;GEVs刺激宿主細(xì)胞,在0h～4 h內(nèi),引起p38在2 h磷酸化水平達(dá)到峰值,、ERK和AKT在4 h磷酸化達(dá)到峰值,阻斷p38和ERK通路可以顯著下調(diào)IL-1β和其它炎性因子IL-6/TNF-α的轉(zhuǎn)錄和分泌,而阻斷AKT通路可以顯著上調(diào)這些炎性因子的轉(zhuǎn)錄和分泌;GEVs刺激宿主細(xì)胞,可引起NF-κB p65入核,在0 h～4 h內(nèi),引起p-p65和p-IKKαβ均在1 h磷酸化水平達(dá)到峰值而T-IκBα降解至水平,阻斷IκBα磷酸化來抑制NF-κB通路可以顯著下調(diào)NLRP3炎性小體信號(hào)IL-1β和其它炎性因子IL-6/TNF-α的轉(zhuǎn)錄和分泌,。

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