一、背景

溶壁微球菌細(xì)胞是一種菌落呈黃色,，細(xì)胞為球形,直徑0.5-3.5微米的細(xì)菌,。一般為單生、對(duì)生何特征性的向幾個(gè)平面分裂而形成不規(guī)則的堆團(tuán),，四聯(lián)或立方堆,。

溶壁微球菌細(xì)胞常常不運(yùn)動(dòng)。溶壁微球菌細(xì)胞未知有休眠階段,；革蘭氏陽性,；化能異養(yǎng)菌，代謝為嚴(yán)格的呼吸型,。溶壁微球菌細(xì)胞產(chǎn)生接觸酶,；好氧；生長(zhǎng)溫度為25℃-30℃,；DNA的G+C含量為66-75%,。

二、溶壁微球菌培養(yǎng)方法主要包括：

1,、溶壁微球菌培養(yǎng)基的制備：將添加適量的營(yíng)養(yǎng)物質(zhì),、碳源和氮源混合溶解，攪拌均勻,，加入適量的水,，經(jīng)加熱消毒后,，即可得到溶壁微球菌培養(yǎng)基。

2,、溶壁微球菌的接種：將溶壁微球菌懸浮液滴入溶壁微球菌培養(yǎng)基中，搖動(dòng)均勻,，加入蓋玻片,，然后置于25℃的恒溫箱中，經(jīng)24小時(shí)培養(yǎng),，即可得到溶壁微球菌的培養(yǎng),。

3、溶壁微球菌的分離：將溶壁微球菌培養(yǎng)液用濾篩分離,，收集濾液,，再置于25℃的恒溫箱中，經(jīng)24小時(shí)培養(yǎng),，即可得到溶壁微球菌的分離,。

4、溶壁微球菌的純化：將溶壁微球菌分離液滴入溶壁微球菌純化培養(yǎng)基中,，搖動(dòng)均勻,，加入蓋玻片，然后置于25℃的恒溫箱中,，經(jīng)24小時(shí)培養(yǎng),，即可得到溶壁微球菌的純化。

溶壁微球菌不耐熱,。微生物菌種應(yīng)保藏于低溫,、清潔和干燥的地方，室溫放置時(shí)間過長(zhǎng)會(huì)導(dǎo)致菌種衰退,。溶壁微球菌具體用于溶菌試驗(yàn),。

三、應(yīng)用

溶壁微球菌細(xì)胞可以用于大菱鲆熱休克蛋白Hsp47的功能研究：

以高溫脅迫條件下,皮膚轉(zhuǎn)錄組測(cè)序數(shù)據(jù)中篩得的熱休克蛋白47(HSP47)基因?yàn)檠芯繉?duì)象,運(yùn)用細(xì)菌結(jié)合,、凝集及抑制等試驗(yàn)方法對(duì)其免疫功能等進(jìn)行研究,分析HSP47在高溫脅迫條件下大量表達(dá)的原因,并通過對(duì)關(guān)鍵位點(diǎn)的定點(diǎn)突變,高效地分析其所表達(dá)的目的蛋白的性狀及表征,從而分析HSP47蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)和功能之間的復(fù)雜關(guān)系,。

大菱鲆熱休克蛋白Hsp47對(duì)病原相關(guān)分子模式的刺激響應(yīng)。通過RACE技術(shù)克隆SmHsp47的c DNA全長(zhǎng)1927bp,并進(jìn)行了生物信息學(xué)分析,與其他物種的序列比對(duì)顯示,分別存在42.76%-81.25%的氨基酸序列一致性,。對(duì)大菱鲆進(jìn)行病原相關(guān)分子模式(Pathogen-associatedmolecular patterns,PAMP)脂多糖(LPS)和磷壁酸(LTA)的刺激,探討SmHsp47基因?qū)ζ浯碳ろ憫?yīng),q PCR實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示,SmHsp47對(duì)LTA具有明顯的刺激響應(yīng),。

大菱鲆熱休克蛋白Hsp47的免疫相關(guān)功能研究。利用已克隆得到的完整SmHsp47基因序列,構(gòu)建了原核表達(dá)載體,經(jīng)誘導(dǎo)表達(dá),最終鑒定目的蛋白主要以包涵體的形式進(jìn)行表達(dá),對(duì)目的蛋白進(jìn)行重組復(fù)性,得到SmHsp47重組蛋白,。對(duì)重組蛋白進(jìn)行了三種絲氨酸蛋白酶抑制活性的研究,結(jié)果顯示SmHsp47對(duì)三種絲氨酸蛋白酶均無抑制活性,屬于非抑制型,。

利用重組蛋白對(duì)細(xì)菌進(jìn)行結(jié)合,實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示,SmHsp47與嗜水氣單胞菌、大腸桿菌,、鰻弧菌,、溶壁微球菌,、金黃色葡萄球菌和枯草芽孢桿菌相互作用,說明SmHsp47可能在細(xì)菌攻擊期間的免疫防御的方面起作用,可能用于識(shí)別入侵細(xì)菌;在體外細(xì)菌凝菌與抑制活性試驗(yàn)中,SmHsp47重組蛋白特異性的對(duì)溶壁微球菌有凝菌及抑菌活性;運(yùn)用His-pull down技術(shù)篩選出在魚體總蛋白中與SmHsp47相互作用的蛋白,為進(jìn)一步分析SmHsp47的功能提供參考。

通過定點(diǎn)突變分析氨基酸位點(diǎn)對(duì)大菱鲆免疫相關(guān)功能的影響,。為了了解SmHsp47結(jié)構(gòu)與功能的關(guān)系,選取了幾個(gè)關(guān)鍵的氨基酸位點(diǎn)進(jìn)行了定點(diǎn)突變,然后分析SmHsp47活性的關(guān)鍵位點(diǎn),。

本實(shí)驗(yàn)構(gòu)建了5個(gè)SmHsp47基因的突變表達(dá)載體,通過對(duì)溶壁微球菌的結(jié)合、凝集以及抑制活性實(shí)驗(yàn)得出以下結(jié)論,Leu368和Tyr370的突變能夠影響SmHsp47蛋白的可溶性表達(dá),從而增加體外抑菌活性,而Ary209,、Asp372,、Asp350-Asn366和Arg402-Leu405均不影響SmHsp47蛋白對(duì)溶壁微球菌的結(jié)合、凝集以及抑制細(xì)菌活性,?？傊?本研究結(jié)果表明SmHsp47對(duì)革蘭氏陽性菌有明顯的刺激響應(yīng),對(duì)溶壁微球菌有明顯的凝集與抑菌作用。

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