一、背景

兔主動(dòng)脈平滑肌細(xì)胞分離自主動(dòng)脈組織,，是一種常用的細(xì)胞模型,，用于研究動(dòng)脈粥樣硬化。它們通常在培養(yǎng)皿中培養(yǎng),，使用DMEM高糖培養(yǎng)基,、10%胎牛血清和1%雙抗,。

兔主動(dòng)脈平滑肌細(xì)胞采用胰蛋白酶-膠原酶聯(lián)合消化法結(jié)合差速貼壁法制備而來(lái)，兔主動(dòng)脈平滑肌細(xì)胞分離自主動(dòng)脈組織,；主動(dòng)脈是體循環(huán)的動(dòng)脈主干,。

其運(yùn)行路徑為：升主動(dòng)脈起于左心室，至右側(cè)第2胸肋關(guān)節(jié)高度移行為主動(dòng)脈弓,，弓行向左后至第4胸椎體下緣移行為降主動(dòng)脈,；在第12胸椎體高度穿膈的主動(dòng)脈裂孔移行為腹主動(dòng)脈，以上為胸主動(dòng)脈,，至第4腰椎體下緣分為左,、右髂總動(dòng)脈；髂總動(dòng)脈在骶髂關(guān)節(jié)高度分為髂內(nèi),、外動(dòng)脈,。主動(dòng)脈平滑肌細(xì)胞原代分離培養(yǎng)3天后，可見(jiàn)細(xì)胞貼壁伸展,，細(xì)胞形態(tài)大小不一,，呈梭形、不規(guī)則形,、三角形或扇形,，核卵圓形、居中,；2周后細(xì)胞匯合,，多數(shù)細(xì)胞伸展呈長(zhǎng)梭形，胞漿豐富,，有分枝狀突起,，細(xì)胞平行排列成單層或部分區(qū)域多層重疊生長(zhǎng)，高低起伏,；

細(xì)胞密度低時(shí),，常交織成網(wǎng)狀；密度高時(shí),，則排列為旋渦狀或柵欄狀,。傳代后細(xì)胞生長(zhǎng)較快，4-6天即可匯合,，并保持上述形態(tài)學(xué)特征和生長(zhǎng)特點(diǎn),。

主動(dòng)脈平滑肌細(xì)胞在心血管疾病發(fā)生、發(fā)展中具有重要作用,，以主動(dòng)脈平滑肌細(xì)胞為實(shí)驗(yàn)研究對(duì)象,，探討心血管疾病相關(guān)發(fā)病機(jī)制是目前研究的熱點(diǎn)；體外培養(yǎng)的主動(dòng)脈平滑肌細(xì)胞對(duì)于研究其生理功能,、藥物作用以及各種致病因素作用下的病理生理改變具重要意義,。

二,、應(yīng)用

兔主動(dòng)脈平滑肌細(xì)胞可以用于鈣感受器STIM1參與主動(dòng)脈平滑肌細(xì)胞衰老的作用機(jī)制研究：

在氧化應(yīng)激誘導(dǎo)的衰老VSMCs模型及自然衰老的動(dòng)物模型中,觀察STIM1是否參與主動(dòng)脈平滑肌細(xì)胞衰老進(jìn)程,及其相關(guān)作用機(jī)制。

方法：使用200μM過(guò)氧化氫溶液(H2O2)處理人主動(dòng)脈平滑肌細(xì)胞(Human aorta vascular smooth muscle cells,HA-VSMCs)2h構(gòu)建氧化應(yīng)激衰老VSMCs模型;C57BL/6分別飼養(yǎng)至3月齡,、12月齡、18月齡,建立自然衰老動(dòng)物模型;Cre-lox P基因重組技術(shù)構(gòu)建平滑肌特異性STIM1敲除小鼠(smc STIM1-/-)模型;采用衰老相關(guān)β-半乳糖苷酶染色檢測(cè)衰老VSMCs陽(yáng)性率;Western blot檢測(cè)細(xì)胞或組織中鈣池操縱性鈣通道(store-operated calcium channel,SOC)相關(guān)蛋白STIM1,、STIM2,、ORAI1表達(dá)水平、衰老相關(guān)標(biāo)記蛋白蛋白p53,、p21,、p16及自噬相關(guān)蛋白p62、LC3B等表達(dá)水平;激光共聚焦測(cè)鈣技術(shù)檢測(cè)單個(gè)細(xì)胞的SOCE的鈣信號(hào)變化,微血管張力測(cè)定技術(shù)檢測(cè)收縮劑誘導(dǎo)的及SOC介導(dǎo)的血管收縮功能;轉(zhuǎn)錄組高通量測(cè)序技術(shù)檢測(cè)STIM1敲除對(duì)主動(dòng)脈平滑肌轉(zhuǎn)錄水平的變化,。透視電鏡檢測(cè)STIM1敲除對(duì)小鼠主動(dòng)脈平滑肌超微結(jié)構(gòu)的影響;m RFP-GFP-LC3串聯(lián)熒光蛋白系統(tǒng)檢測(cè)細(xì)胞自噬流變化;流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞內(nèi)活性氧(reactive oxygen species,ROS)水平,。

結(jié)果：

(1)在H2O2誘導(dǎo)的衰老VSMCs模型上,衰老相關(guān)蛋白p21、p16表達(dá)上調(diào),衰老相關(guān)β-半乳糖苷酶染色陽(yáng)性細(xì)胞率增加,伴STIM1及ORAI1蛋白表達(dá)下調(diào),SOCE水平降低;

(2)老齡小鼠(12月齡,、18月齡)主動(dòng)脈組織SOC相關(guān)蛋白STIM1和ORAI1表達(dá)下調(diào),以及SOC通道介導(dǎo)的血管收縮反應(yīng)下降,；

(3)smc STIM1-/-小鼠主動(dòng)脈組織中STIM1水平下降,而STIM2及ORAI1蛋白表達(dá)無(wú)明顯差異,SOC介導(dǎo)的收縮反應(yīng)幾乎消失,不同濃度的Phe誘導(dǎo)的血管收縮無(wú)明顯差異,然而在硝苯地平預(yù)處理后,有或無(wú)細(xì)胞外鈣條件下血管收縮幾乎消失;

(4)smc STIM1-/-小鼠主動(dòng)脈衰老相關(guān)蛋白p53、p21及p16均上調(diào),sh STIM1下調(diào)細(xì)胞STIM1表達(dá),并伴隨著衰老相關(guān)蛋白p53,、p21及p16表達(dá)以及ROS水平的增加;

(5)smc STIM1-/-小鼠主動(dòng)脈組織轉(zhuǎn)錄組高通量測(cè)序顯示下調(diào)基因富集在自噬與線粒體自噬中;

(6)smc STIM1-/-小鼠主動(dòng)脈組織,超微結(jié)構(gòu)下線粒體腫脹,、嵴消失,線粒體面積及長(zhǎng)度顯著增加,線粒體分裂相關(guān)蛋白FIS1顯著下調(diào),線粒體融合蛋白MFN2表達(dá)上調(diào),自噬相關(guān)蛋白PINK1、Parkin表達(dá)下調(diào),p62表達(dá)上調(diào);

(7)sh STIM1下調(diào)細(xì)胞STIM1表達(dá)后,自噬相關(guān)蛋白p62,、LC3BII表達(dá)上調(diào),進(jìn)一步使用HCQ處理后,sh STIM1+HCQ組LC3BII表達(dá)量不高于sh NC+HCQ組,。

(8)m RFP-GFP-LC3串聯(lián)熒光蛋白系統(tǒng)檢測(cè),提示氧化應(yīng)激衰老VSMCs模型自噬小體數(shù)量顯著增多,而自噬溶酶體數(shù)量增加不變;在衰老VSMCs模型中過(guò)表達(dá)STIM1導(dǎo)致自噬溶酶體數(shù)量顯著增多,并比自噬小體數(shù)量多,HCQ處理可逆轉(zhuǎn)該過(guò)程。

(9)過(guò)表達(dá)STIM1能夠減少衰老VSMCs p21,、p16表達(dá)以及ROS水平上調(diào),以及衰老相關(guān)β-半乳糖苷酶染色陽(yáng)性細(xì)胞率增加,且HCQ處理后被逆轉(zhuǎn),。

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