一、細(xì)胞簡(jiǎn)介

平臺(tái)編號(hào)：Bio-73445

規(guī)格：1×10?Cells/T25培養(yǎng)瓶

細(xì)胞信息：C6/36

細(xì)胞名稱：C6/36（蚊子細(xì)胞）

種屬：蚊子

年齡（性別）：幼蟲

生長(zhǎng)特性：貼壁

生長(zhǎng)培養(yǎng)基：MEM＋10% FBS＋1% P/S

培養(yǎng)條件：氣相：空氣,，95%,；CO2，5% 溫度：28℃

用途：研究

注意事項(xiàng)：僅用于科學(xué)研究或者工業(yè)應(yīng)用等非醫(yī)療目的不可用于人類或動(dòng)物的臨床診斷或治療,，非藥用,，非食用（產(chǎn)品信息以出庫(kù)為準(zhǔn)）

二、產(chǎn)品特點(diǎn)

特點(diǎn)：細(xì)胞代數(shù)為4-5代左右

包裝：內(nèi)層無(wú)菌自封袋,；專用防壓泡沫盒,；外層防壓保溫氣泡袋；說(shuō)明書

細(xì)胞來(lái)源：ATCC,、sciencell,、ICLC

貨期：1-2周

運(yùn)輸方式：快遞運(yùn)輸

形態(tài)：上皮細(xì)胞樣

三、細(xì)胞的凍存和復(fù)蘇

實(shí)驗(yàn)方法原理

細(xì)胞凍存及復(fù)蘇的基本原則是慢凍快融,，實(shí)驗(yàn)證明這樣可以限度的保存細(xì)胞活力。目前細(xì)胞凍存多采用甘油或二甲基亞砜作保護(hù)劑,，這兩種物質(zhì)能提高細(xì)胞膜對(duì)水的通透性,，加上緩慢冷凍可使細(xì)胞內(nèi)的水分滲出細(xì)胞外，減少細(xì)胞內(nèi)冰晶的形成,，從而減少由于冰晶形成造成的細(xì)胞損傷。復(fù)蘇細(xì)胞應(yīng)采用快速融化的方法,，這樣可以保證細(xì)胞外結(jié)晶在很短的時(shí)間內(nèi)即融化,，避免由于緩慢融化使水分滲入細(xì)胞內(nèi)形成胞內(nèi)再結(jié)晶對(duì)細(xì)胞造成損傷。

四、操作流程

（一）材料準(zhǔn)備

1,、儀器：凈化工作臺(tái)、 離心機(jī),、恒溫水浴箱,、冰箱（4℃,、-20℃,、-70℃）,、倒置相差顯微鏡,、培養(yǎng)箱,、液氮冰箱,。

2,、玻璃器皿：吸管（彎頭,、直頭）、 培養(yǎng)瓶,、玻璃瓶（250ml,、100ml）、廢液缸,。

3,、塑料器皿： 吸頭,、槍頭,、膠塞,、移液管（10ml）,、15ml離心管,、凍存管（1～2ml）,。

4、其他物品：微量加樣槍、紅血球計(jì)數(shù)板,、記號(hào)筆、醫(yī)用橡皮膏,、移液槍。

5,、試劑：D-Hanks液,、小牛血清,、培養(yǎng)液,、雙抗（青霉素、鏈霉素）,、胰蛋白酶（0.08%）,、1NHCl、7.4%NaHCO3,、DMSO（分析純）或無(wú)色新鮮甘油,。

（二）蚊子細(xì)胞C6/36系細(xì)胞凍存

1、配制含10%DMSO或甘油,、10～20%小牛血清的凍存培養(yǎng)液。

2、取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的細(xì)胞,，用胰蛋白酶把單層生長(zhǎng)的細(xì)胞消化下來(lái),，懸浮生長(zhǎng)的細(xì)胞則直接將細(xì)胞移至15ml離心管中,。

3,、離心1 000 rpm,，5 min,。

4,、去除胰蛋白酶及舊的培養(yǎng)液,，加入適量配制好的凍存培養(yǎng)液,，用吸管輕輕吹打使細(xì)胞均勻,，計(jì)數(shù),，調(diào)節(jié)凍存液中細(xì)胞的最終密度為5×106/ml～1×107/ml。

5,、將細(xì)胞分裝入凍存管中,，每管1～1.5 ml。

6,、在凍存管上標(biāo)明細(xì)胞的名稱,，凍存時(shí)間及操作者。

7,、凍存：標(biāo)準(zhǔn)的凍存程序?yàn)榻禍厮俾?1～-2℃/ min,；當(dāng)溫度達(dá)-25℃以下時(shí)，可增至-5℃～-10℃/min,；到-100℃時(shí),，則可迅速浸入液氮中。也可將裝有細(xì)胞的凍存管放入-20℃冰箱2 h ,，然后放入-70℃冰箱中過(guò)夜,，取出凍存管，移入液氮容器內(nèi),。

（三）細(xì)胞復(fù)蘇

1,、從液氮容器中取出凍存管,，直接浸入37℃溫水中，并不時(shí)搖動(dòng)令其盡快融化,。

2,、從37℃水浴中取出凍存管,，打開蓋子，用吸管吸出細(xì)胞懸液,，加到離心管并滴加10倍以上培養(yǎng)液,，混勻,。

3,、離心， 1 000 rpm,，5 min,。

4,、棄去上清液,，加入含10%小牛血清培養(yǎng)液重懸細(xì)胞,，計(jì)數(shù),，調(diào)整細(xì)胞密度,，接種培養(yǎng)瓶,，37℃培養(yǎng)箱靜置培養(yǎng),。

5,、次日更換一次培養(yǎng)液,，繼續(xù)培養(yǎng)。

五,、適用范圍

1、從增殖期到形成致密的單層細(xì)胞以前的培養(yǎng)細(xì)胞都可以用于凍存,，但為對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期細(xì)胞。在凍存前一天換一次培養(yǎng)液,。

2,、將凍存管放入液氮容器或從中取出時(shí),，要做好防護(hù)工作，以免凍傷,。

3、凍存和復(fù)蘇用新配制的培養(yǎng)液,。

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